Northern blot實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)方法
- Northern blot技術(shù)
- Northern Blot
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標(biāo)記DNA或RNA特異性探針對(duì)固定于固相膜上的mRNA進(jìn)行雜交，洗膜去除非特異性結(jié)合雜交信號(hào)，經(jīng)放射自顯影或現(xiàn)色反應(yīng)，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標(biāo)準(zhǔn)分子量分子進(jìn)行比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大��；對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱比較，可以知曉該基因表達(dá)mRNA水平的強(qiáng)弱。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
DNA |
| 試劑、試劑盒 |
MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器、耗材 |
水平電泳儀 制冰機(jī) 恒溫水浴箱 凝膠成像系統(tǒng) EP管 移液器 Tip頭 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、RNA轉(zhuǎn)移與固定
1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。 2. 按southern blot實(shí)驗(yàn)中DNA轉(zhuǎn)移方法及裝置轉(zhuǎn)移總RNA至尼龍膜上（過(guò)程中注意無(wú)RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時(shí)。
4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍(lán)溶液中浸泡5~10 min。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見(jiàn)RNA標(biāo)準(zhǔn)及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標(biāo)記。 二、預(yù)雜交、雜交及顯色
1. Washing buffer潤(rùn)洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。
7. 當(dāng)出現(xiàn)條帶時(shí)，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現(xiàn)色。 8. 照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。
9. 掃描計(jì)算EGFR基因擴(kuò)增的倍數(shù)。 |
| 注意事項(xiàng) |
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝膠中最好不要加入EB，以免降低雜交的效率。 3. 為降低膜雜交本底，可適當(dāng)延長(zhǎng)預(yù)雜交時(shí)間。 |
- c-MET靶點(diǎn)的特性及相關(guān)小分子抑制劑、雙抗和ADC藥物研發(fā)進(jìn)展
- Nature文獻(xiàn)解讀：紫杉醇完整合成路徑的突破性研究
- 人類(lèi)癌癥中TERT轉(zhuǎn)錄激活及端粒酶活性激的機(jī)制：老演員與新角色
- 角蛋白的基因結(jié)構(gòu)、中間絲特性、表達(dá)模式及其與皮膚病癥的關(guān)系
- Ni/光氧化還原雙催化助力構(gòu)建Csp2-Csp3鍵
- 細(xì)胞角蛋白標(biāo)記物在肺癌、間皮瘤和胸腺瘤診斷中的應(yīng)用
- 霍亂毒素的結(jié)構(gòu)、功能和致病機(jī)制及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
- 使用Streptozotocin構(gòu)建大小鼠糖尿病模型的機(jī)制及其應(yīng)用案例
- 分子檢測(cè)試劑供應(yīng)商尚睿生物向全國(guó)招募經(jīng)銷(xiāo)商
- 陶術(shù)生物技術(shù)講座預(yù)告：人工智能藥物設(shè)計(jì)的實(shí)用方法
- 暑期福利,勤翔ECL化學(xué)發(fā)光液試劑、核酸染料買(mǎi)二送一
- 美德聲推出分子生物學(xué)診斷解決方案，含多款檢測(cè)試劑
- 尚睿生物618產(chǎn)品年中大促,免費(fèi)試等活動(dòng)鉅惠來(lái)襲
- MCE攜手華東師范大學(xué)打造AI藥物探索聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室
- 棱鏡泰克19款流式試劑獲證，產(chǎn)品矩陣擴(kuò)至51款
- 美德聲推出多款基于新一代測(cè)序技術(shù)的體外診斷試劑盒
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com