酵母質(zhì)粒提取離心法操作步驟

瀏覽次數(shù)：4802　發(fā)布日期：2013-3-11　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

酵母質(zhì)粒提取離心法操作步驟：

1. 接種5 mL含有酵母攜帶所需質(zhì)粒的YDP培養(yǎng)液，將其振蕩培養(yǎng)在30℃16-24小時(shí)。

2. 取1-3ml酵母培養(yǎng)菌體(使用< 2×107細(xì)胞)，室溫下5000× g離心5 min。

3. 棄培養(yǎng)液，收集菌體，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase solution。以最快的速度渦旋懸浮1min。充分懸浮細(xì)胞顆粒有助于提高得率。將其置于30℃消化30min左右。

注：在使用前確保β-mercaptoethanol已添加到Buffer SE (10µL /毫升)中，這種混合液可以在室溫很好的放置時(shí)間為1周。

4. 將混合液顆粒在4,000 x g室溫離心5min，棄上清完全。

5. 加入250 µL Buffer YPI重新懸浮混合液顆粒。

6. 加入50 mg 玻璃珠，然后以最快速度渦旋5min，讓樣品在玻璃珠作用下沉降穩(wěn)定下來(lái)。轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)1.5ml離心管中。

7. 加入250 µL Buffer YPII，反復(fù)顛倒混勻離心管4-6次以獲得干凈的溶解產(chǎn)物。將其室溫放置5 min。

注：此步應(yīng)避免高強(qiáng)度混合，因?yàn)檫@將使染色體DNA斷裂以及降低質(zhì)粒純度。YPII在存儲(chǔ)時(shí)要蓋緊蓋子。

8. 加入350µL Buffer YP III，用手大幅度顛倒混勻樣品直到形成絮凝白色沉淀。室溫下13,000 × g離心10min。

9. 將干凈的上清液小心轉(zhuǎn)移至DNA Mini Column，取上清時(shí)盡量不要打擾顆粒與沉淀。室溫下10,000 × g離心30s。倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。

10. 向吸附柱中加入500 μL Buffer KB，12,000 rpm轉(zhuǎn)離心30秒，棄收集管與廢液。

11. 將吸附柱放入一個(gè)新的收集管中，加入650 μL Wash Bufffer（確保已加入乙醇），12,000離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。

注：Wash Buffer 用無(wú)水乙醇稀釋后使用。

12. 可選步驟：重復(fù)步驟11。

13. 13,000 rpm 開(kāi)蓋離心2分鐘。

注：開(kāi)蓋離心有助于去除殘留乙醇，乙醇的有效去除保證DNA的洗脫。

14. 將柱子放入一個(gè)新的1.5ml離心管中，向柱中加入50-100 µL Elution Buffer(10 mM Tris-HCL, pH 8.5)，室溫放置1 min，13,000 x g離心1 min進(jìn)行洗脫。

可選步驟：第一次洗脫通常能得到75-80% DNA，用50-100 µL預(yù)熱(65°C) Elution Buffer再次洗脫DNA，第2次洗脫可收獲另外20%的DNA

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