資料來源：http://www.bio-will.com/pdlistone/tech/739377.html

[摘　要]　目的: 探討慢性癲癇對大鼠空間記憶再生能力的影響, 檢測組胺前體物質組氨酸和膽堿酯酶抑制劑TA K2147 對癲癇誘發記憶障礙的作用。

方法: 大鼠在放射狀八臂(四臂放食物)迷宮訓練成功后, 隔日腹腔注射亞驚厥劑量(35mgö kg)的戊四唑, 直至完全點燃。完全點燃后在同一迷宮中測記憶的再現過程。

結果: 完全點燃后第1 d 至第 18 d, 大鼠在放射狀迷宮中的錯誤次數較對照組明顯上升, 且維持在一相對平衡的狀態, 31 d 后與對照組一致。TA K2147 劑量依賴性地改善了癲癇誘發的空間記憶再現障礙, 包括參考記憶和工作記憶。組氨酸劑量依賴性地改善參考記憶, 不影響工作記憶。

結論: 戊四唑點燃癲癇可導致大鼠空間記憶再生能力下降, 可能與癲癇造成的膽堿能神經和組胺能神經活性降低有關。

[關鍵詞]癲癇/化學誘導，放射狀迷宮，記憶障礙，膽堿酯酶抑制劑/藥理學，組氨酸/藥理學

癲癇所造成的危害不僅在于癲癇發作本身, 還在于反復發作的慢性癲癇所致的智能障礙。有報道稱, 45%的癲癇患者有記憶障礙等行為異常, 10%～ 20%的癲癇兒童需要特殊的教育[ 1 ]。因此, 研究癲癇造成學習記憶障礙的機制和篩選治療這種學習記憶障礙的藥物較為迫切。戊四唑(PTZ)是一種中樞興奮劑, 反復使用亞驚厥劑量的戊四唑, 可以使動物的驚厥閾值降低, 最后造成“點燃”。戊四唑點燃模型是一種慢性癲癇模型, 常被用來研究癲癇的發病機制和抗癲癇藥物的效果, 是最常用的癲癇模型之一[ 2, 3 ]。放射狀八臂(四臂放食物)是一種經典的測定動物空間記憶的方法, 它可以同時檢測動物的參照記憶( reference m emo ry)和工作記憶(wo rk ing m emo ry)。為此, 本實驗用放射狀迷宮測定戊四唑點燃大鼠的空間記憶再現的方式, 研究癲癇與學習記憶的關系和機制,并初步評價了兩種被認為能改善記憶障礙的化合物TAK2147和組氨酸, 為治療癲癇患者的記憶損害提供線索。

1　材料和方法

1 . 1　動物和分組　SD大鼠50只, 雄性, 體重220～300g (浙江大學醫學院實驗動物中心提供) ,清潔級Ê級, 證書號: 2229601018。將 SD大鼠隨機分成PTZ 點燃組(n= 40)和對照組(n=10) , 并分籠分組飼養, 自由進水, 每天給12h的光照(光照時間: 8∶00～20∶00)。在進行八臂迷宮實驗前限制大鼠飲食, 使其體重維持在自由進食體重的80%～85%。行為學觀察在10∶00～ 17∶00 進行。

1 . 2　迷宮訓練　采用放射狀八臂(四臂放食物)迷宮。迷宮中央區直徑30cm , 向四周以等角度和等長度延伸八條臂(50cm×12cm , 圍以4.5cm高的墻)。整個迷宮高出地面40 cm。訓練前大鼠先在迷宮中適應2 d, 每天1次。適應時3至4只大鼠同時置于迷宮中, 自由活動和攝取食物10min。適應后進行每天1次的訓練。每次訓練中, 八臂中只有四臂放置了食物(分別為 3、5、6 和8號臂) , 整個實驗過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央區, 此時中央區四周用門關住 15 s 將門打開, 大鼠可選擇進入任意一臂, 以攝取食物。大鼠進入有食物的臂且攝取了食物為1 次正確選擇, 否則為錯誤選擇。記錄參數為錯誤選擇的次數。重新進入放食物臂稱為工作記憶錯誤(wo rk ing m emo ry er ro r,WM E) , 進入不放食物臂稱為參考記憶錯誤( reference m emo ry er ro r, RM E)。連續5 次訓練總錯誤選擇次數為 1 次或 1 次以下, 認為訓練成功。

1 . 3　戊四唑點燃模型　迷宮訓練成功后, 戊四唑點燃組大鼠腹腔注射PTZ35mgökg,48h1次,非點燃組腹腔注射同樣體積的生理鹽水。每次注射后, 大鼠單獨放在透明的玻璃籠子里, 觀察行為變化30min。癲癇發作嚴重程度根據文獻[2,3]分級: 0= 無反應;1=耳朵和面部抽動, 包括眨眼,動須,節奏性咀嚼;2=肌陣攣, 但無直立;3=肌陣攣, 兩前肢抬起;4=側身倒地; 5=背部倒地,全身強直-陣攣發作或死亡。若動物連續3 次注射PTZ 后發作級別達4級或5級,則認為完全點燃。大鼠完全點燃后24 h開始測記憶的再現過程, 整個測定過程參照物體和放食物臂同訓練過程一致。

1 . 4　藥物　戊四唑和組氨酸購自 Sigm a 公司, TA K2147 由日本武田制藥公司提供。所有的藥物均溶于生理鹽水。組氨酸和 TA K2147分別在記憶測試前 2 h 和30 m in 腹腔注射。

1 . 5　統計學處理　采用 Sigm a Stat 1. 01(W indow s 95 1992, Co rp ,U SA )統計學軟件進行數據的分析處理。數據均以xq±s 表示。組間比較用ANOVA及Dunnet t’s檢驗。

2　結　果

2 . 1　完全點燃后1d、7d、11d、16d和18 d,RME分別為: 215±015、218±015、218±015、218±017和219±016;WME分別為:116±014、118±015、210±016、119±016和118±015,與對照組相比明顯增加(P<0105),且維持在一相對平衡的狀態, 適合測試藥物效果。 18d后上述指標開始下降, 至31d基本和非點燃組持平,如完全點燃后23d和31d,RME分別降為210±016和113±016,WME分別降為018±013和015±014。而對照組的RME和WM E分別自始至終保持在111±016～113±015和012±012～013±012之間。

2.2　在完全點燃后1～18d測TAK2147對記憶再現的作用。TA K2147劑量依賴性地減少了RM E。如表1 所示, 013m gö kg 的TA K2147 使RM E 和WM E 均顯著減少 (P < 0105) , 011m gö kg 的TA K2147 也使RM E 顯著減少(P <0105)。

2.3　在完全點燃后1～18d測組氨酸對記憶再現的作用。組氨酸(1 000m gö kg)可以顯著性地減少 RM E (P < 0105) , 卻不影響WM E。

3　討　論

本實驗發現, 戊四唑點燃使訓練成功的大鼠在放射狀八臂迷宮的錯誤選擇次數(包括RM E 和WM E)明顯增多, 并且在完全點燃后1至18 d 內保持在一相對穩定的狀態。有關癲癇大鼠學習記憶的研究, 電點燃模型的研究較多,用化學點燃模型者少見。與電點燃模型相比, 戊四唑化學點燃模型具有制作方便、成功率高、不破壞腦組織結構等優點。另外, 戊四唑是一種GABAA 受體的拮抗劑, 其本身對記憶無明顯影響。本實驗結果表明, 大鼠戊四唑點燃有希望成為研究癲癇誘發學習記憶障礙的模型, 并用于評價和篩選治療癲癇誘發的認知功能障礙的藥物。乙酰膽堿對學習的獲得和記憶的保持都至關重要。Ser ra 等報道戊四唑點燃使自由活動的大鼠海馬中乙酰膽堿含量下降至對照組的52%,并維持這水平達4周, 至停止戊四唑注射后30d 恢復至對照組水平[7]。我們的行為學結果與Ser ra 的生化結果具有時間的一致性, 這提示慢性癲癇誘發的記憶障礙可能與腦內乙酰膽堿含量下降有關。TAK2147是一種選擇性較強的膽堿酯酶抑制劑, 可以活化腦內膽堿能神經。我們發現TA K2147 的作用可能正是在于它改善了點燃造成的海馬乙酰膽堿功能的低下, 從而改善了戊四唑點燃誘發的大鼠空間記憶再現障礙。

此外, 腦內組胺也被認為可以改善學習記憶, 組胺的作用與激活腦內組胺H1 受體和活化膽堿能神經有關[ 8 ]。目前雖無戊四唑點燃與腦內組胺含量關系的報道, 但已經報道杏仁核電刺激至完全點燃, 停止電刺激后 1 周腦內組胺含量下降, 1 個月后恢復至點燃前水平[ 9 ]。組胺前體組氨酸可以增加腦內組胺含量。組氨酸可能通過增加腦內組胺含量激活組胺H1 受體和ö 或活化膽堿能神經, 改善戊四唑點燃誘發的大鼠記憶再現障礙。我們曾報道組胺可以抑制戊四唑點燃癲癇的形成過程和點燃后的發作過程, 因此, 組胺的相關藥物可能成為較好的抗癲癇藥或治療癲癇的輔助藥。而且有趣的是, 組氨酸僅對參照記憶有改善作用, 對工作記憶沒有效果, 這一結果也進一步證實了我們先前的結果, 即內源性組胺對參照記憶和工作記憶的作用出現分離。綜上所述, 大鼠戊四唑點燃造成了空間記憶再現障礙, 可能跟點燃造成的膽堿能神經和組胺能神經活性降低有關, 其具體機制還需要做進一步的探討。我們的研究結果給癲癇與認知功能的關系研究和癲癇誘發記憶障礙的藥物治療評價, 提出了新的思路和線索。