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原代細胞中期染色體的分離

瀏覽次數:2148 發布日期:2011-1-20  來源:www.pricells.com.cn
                              原代細胞中期染色體的分離

試劑和器材: 
1. 秋水仙胺;
2. 2-甲-2,4-戊二醇緩沖液:1mol/L 2-甲-2,4-戊二醇、0.5mmol/L CaCl2、0.1mmol/L Pipes-NaOH,pH6.8;
3. 梯度溶液:用2-甲-2,4-戊二醇緩沖液配制成280g/L、580g/L和600g/L的Nycodenz○R;
4. 二甲基二氯硅烷(10g/L濃度溶于四氯化碳中);
5. 低速離心機與高速離心機;
6. 高速離心機,配吊桶式轉子;
7. 用于吊桶式轉子的15ml Corex管;
8. 23號注射器,帶金屬套管針;
9. 相差顯微鏡;
10. 雙室梯度儀或者Gradient MasterTM;

實驗方法:
1. 用二甲基二氯硅烷處理Corex管5min,然后60℃烘烤24h;
2. 向培養基中添加6×10-5g/ml的秋水仙胺,使培養原代細胞停滯在細胞分裂的中期,并孵育3h;
3. 輕輕振搖以選擇性分離中期細胞,對分離的原代細胞4℃預冷20min,300g離心5min使之沉淀;
4. 用2-甲-2,4-戊二醇緩沖液重懸原代細胞并洗滌,之后再沉淀細胞(同步驟3);
5. 以相同的緩沖液重懸細胞(細胞濃度應小于2g/L),37℃孵育10min,用23號注射針抽吸細胞懸液數次以裂解細胞,通過相差顯微鏡觀察監視裂解過程;
6. 2000g離心10min以沉淀染色體;
7. 在處理過的Corex管中用等體積的280g/L和580g/L Nycodenz○R制備10ml梯度溶液,并將用600g/L Nycodenz○R懸浮的染色體沉淀放置于管底;
8. 16300g離心10min,染色體帶(密度約為1.23g/ml)大約處于梯度的2/3位置;
9. 原代細胞中期染色體可以通過顯帶法染色;

發布者:武漢原生原代生物醫藥科技有限公司
聯系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

標簽: 原代細胞
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