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正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的長期培養(yǎng)

瀏覽次數(shù):2571 發(fā)布日期:2010-9-13  來源:www.pricells.com.cn
正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的長期培養(yǎng)
 
實(shí)驗(yàn)材料:
1.    軟骨細(xì)胞來源:20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨和脛骨;
2.    清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,pH7.2;
3.    消化液Ⅰ:2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml膠原酶混合消化液,用PBS液配制;
4.    消化液Ⅱ:0.5mg/ml膠原酶,用培養(yǎng)液Ⅰ配制;
5.    培養(yǎng)液Ⅰ:DMEM培養(yǎng)液,補(bǔ)充10%胎牛血清;
6.    培養(yǎng)液Ⅱ:DMEM培養(yǎng)液中補(bǔ)加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、鏈霉素1mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%維生素添加劑(vitamin supplements)以及維生素C 50μg/ml;
7.    10% poly HEMA:稱取6g多聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯(2-hydroxyethylmethacrylate,poly HEMA),加到50ml 95%乙醇中,于37℃恒溫振蕩水浴箱中緩慢振蕩過夜,次日將所得溶液離心(2500r/min,10min),除去未溶解的顆粒,此為干液。取1ml干液與9ml 95%乙醇混合,稀釋成10%(V/V)的poly HEMA溶液;
8.    篩網(wǎng):孔徑為100μm的尼龍篩網(wǎng);
 
實(shí)驗(yàn)方法:
1.    在無菌條件下,從20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨頭和脛骨坪切取骺軟骨。用PBS液洗凈血液。盡量除去纖維性組織;
2.    將軟骨放入消化液Ⅰ中,于37℃孵育1h;
3.    棄孵育液。將軟骨塊充分切碎,加入消化液Ⅱ,在37℃孵育過夜;
4.    用尼龍篩網(wǎng)過濾,濾液中加入培養(yǎng)液Ⅰ。再經(jīng)250g離心5min,棄上清液;
5.    用培養(yǎng)液Ⅰ將細(xì)胞團(tuán)吹散,重新懸浮細(xì)胞,離心。重復(fù)4次。用培養(yǎng)液將最后得到的細(xì)胞團(tuán)制成懸液;
6.    計(jì)數(shù)細(xì)胞。從每克軟骨平均可獲得大約3.0×108個(gè)軟骨細(xì)胞;
7.    取0.9ml 10% poly HEMA溶液鋪在直徑為60mm的塑料培養(yǎng)皿內(nèi),水平放置在通風(fēng)的超凈工作臺上干燥(過夜);
8.    使用前將包被poly HEMA的培養(yǎng)皿用滅菌紫外燈照射30min;
9.    將含5×106個(gè)軟骨細(xì)胞的懸液接種到已包被poly HEMA的培養(yǎng)皿中,在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
10.每3—4d換一次液。培養(yǎng)可持續(xù)半年以上;
 
發(fā)布者:武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司
聯(lián)系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

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