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植物病毒分離方案

瀏覽次數:4656 發布日期:2008-12-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
植物病毒分離方案
 
方案一:
帶病毒的植物葉、莖、果實、根等粉碎后—20℃冰凍后制成勻漿→用0.5M,PH7.0檸檬酸緩沖液抽提→雙層紗布過濾→濾液加入6%PEG(MW6,000)及3%Nacl,充分攪拌40分鐘,置冰箱4℃過夜→高速冷凍離心機8×50ml轉頭,7000rpm,4℃離心20分鐘,棄上清,取沉淀→沉淀是浮于0.005M,PH8.5的硼酸緩沖液(含0.05M尿素或1%,Triton X-100)中,7000rpm,4℃離心20分,取上清液→超速離心:10%~40%蔗糖梯度,日立P40ST轉頭30,000rpm,4℃離心3小時→每管自上而下收集成30管,每管約400μl,分別做260nm及280nm O.D.,繪成曲線,收集病毒帶(峰前后收集管)。根據260nm及280nm的O.D.值的比值估計樣品的純度
 
方案二:
帶病毒的植物葉、莖、果實、根等粉碎后—20℃冰凍后制成勻漿→加5倍體積的0.1M,PH8.2的硼酸緩沖液(含2%PVP,2%尼古丁,0.01M EDTA和0.2%硫基乙醇)攪拌,雙層紗布過濾→濾液在高速冷凍離心機6,000rpm,4℃離心20分→取上清液,加入6%PEG(MW6000),0.1M Nacl和1% Triton X-100,冰浴中攪拌至完全溶解,4℃過夜→高速機10,000rpm,4℃離心30分鐘→取沉淀,懸浮于0.01M PH7.2的磷酸緩沖液(含0.001M EDTA和0.1% PVP)10,000rpm,4℃離心30分鐘→取上清液,P40ST轉頭每管內鋪5ml用以上懸浮液配置的20% w/w蔗糖(分析純),上部鋪上清液至距管口3mm,35,000rpm,4℃離心3小時→取沉淀,用以上懸浮物稀釋后10,000rpm,4℃離心20分→取上清液,P40ST轉頭,10%~40%蔗糖梯度,每管樣品約1ml,28,000rpm,4℃,3.5小時→從上部開始收集成30管,每管約400μl,分別測O.D.,繪成管數(橫坐標)對O.D.(豎坐標)曲線,找到病毒峰所在離心管(取3-5管)→稀釋后40,000rpm,4℃離心2小時→沉淀,懸浮即為純病毒成份。
 

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