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蛋白定量技術服務

蛋白定量技術服務


蛋白定量技術服務
收集完蛋白樣品后,為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同,需要采用適當的蛋白濃度測定方法。
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蛋白定量技術服務
蛋白定量
收集完蛋白樣品后,為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同,需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

常用的蛋白定量方法有:
● Bradford法: | 
檢測原理: Bradford與蛋白質四級結構,特殊氨基酸結合,由棕色變成藍色,595nm檢測.該方法用于大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果,如TritonX-100,SDS,NP-40等。
● Lowry法:
檢測原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡合物,菲林試劑增強蘭色形成,750nm檢測. 
● 紫外分光光度法: 
檢測原理:是因蛋白質樣品在280nm波長下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在. 

三種蛋白定量方法的比較: 

 方法  靈敏度  時間  原理  干擾物質  說明
 紫外吸收法  較為靈敏
 50~100μg
 快速
 5~10分鐘
 蛋白質中的酪氨酸
 色氨酸殘基在280nm處的光吸收
 各種嘌吟和嘧啶各種核苷酸  用于層析柱流出液的檢測;
 核酸的吸收可以校正
 Folin-酚試劑法
(Lowry法)
 靈敏度高
 1~5μg
 慢速
 40~60分鐘
 雙縮脲反應;磷鉬酸-磷鎢酸試劑
 被Tyr和Phe還原
 硫酸銨Tris緩沖液甘氨酸各種硫醇  耗費時間長;操作要嚴格計時
 色深淺隨不同蛋白質變化
 
 考馬斯亮藍法
(Bradford法)
 靈敏度最高
1~5μg
 快速
 5~15分鐘
 考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時,其
 最大吸光值由465nm變為595nm
 強堿性緩沖液;TritonX-100;SDS  最好的方法
 干擾物質少;顏色穩定,顏色深淺隨不同蛋白質變化

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