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Western Blot檢測(免疫印跡檢測)
免疫印跡檢測
服務類別:免疫與抗體總訪問:839
最后更新:2024-1-15半年訪問:1
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  • 公司簡介

 通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
操作方法:
      一蛋白質樣品獲得:細菌誘導表達后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞,真核細胞加勻漿緩沖液,機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃,13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

二電泳:制備電泳凝膠,進行SDS-PAGE。

三轉移:(半干式轉移)

1、電泳結束后將膠條割至合適大小,用轉膜緩沖液平衡,5min×3次。

2、膜處理:預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉膜緩沖液中10min。

3、轉膜:轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜精確對齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2,轉移1.5hr。轉移結束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結果作對比。

四免疫反應:

1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。

2、加入包被液,平穩搖動,室溫2hr。

3、棄包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。

4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部),4℃ 放置12hr以上。陰性對照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與實驗組相同。

5、棄一抗和1%BSA,用0.01M PBS分別洗膜,5min×4次。

6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋),平穩搖動,室溫2hr。

7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。

8、加入顯色液,避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。

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