傳統(tǒng)的Western Blot，耗時長，手工操作多，重現(xiàn)性差（CV>35%）。遇到珍貴樣本（蛋白量不足）通常會進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）的方式進行蛋白質多靶點的分析。

然而，傳統(tǒng)Western Blot進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）時會面臨：

1.洗脫次數(shù)不夠，無法充分解離靶點和抗體，影響二次雜交。

2.洗脫次數(shù)太多，膜上靶點丟失太多，定量更加不準。

3.每個靶點和抗體親和力不同，沒有通用試劑和方法。
 

為了克服這些局限性，

ProteinSimple Jess RePlex技術正式上線！！
 

Jess RePlex檢測技術特點：

• 只需1份3μl樣本(分選干細胞、免疫微環(huán)境細胞、珍稀臨床樣本等）

• 2次連續(xù)自動檢測：一根毛細管洗脫-重雜交技術

• 結合Jess多通道檢測：化學發(fā)光、雙色紅外熒光、總蛋白檢測通道

• 實現(xiàn)珍貴樣品多靶點的定量檢測分析（不同靶蛋白、靶蛋白不同亞型、靶蛋白磷酸化、樣本總蛋白等）
   

Jess RePlex檢測原理：

Jess RePlex應用舉例：

RePlex超高的洗脫效率
 

RePlex中的關鍵步驟是在第一輪探測后能有效去除抗體。因此，評估了針對Jurkat和MCF7裂解物的pan AKT/AKT1/AKT2/p-AKT1/p-AKT2/p-GSK3b抗體的去除效率。結果顯示，所有測試的抗體均顯示出超過96％的去除效率，而大多數(shù)測試的抗體均顯示出98％或更高的去除率。這些數(shù)據(jù)表明進行第二輪抗體探測時，與第一輪探測幾乎沒有交叉。
 

RePlex出色的重雜交信號強度和高重復性

為了證明探針1和探針2之間的信號強度和可重復性沒有受到影響，在兩個檢測步驟中測量了MCF7裂解物中AKT1和AKT2抗體的信號強度。結果顯示，不管檢測每種蛋白質的順序如何，在RePlex分析中在探針1或探針2中檢測到的MCF7裂解物中的AKT1和AKT2在兩個檢測周期中均具有出色的重現(xiàn)性和相似的信號強度。
 

一份樣品不同靶點的檢測
 

RePlex檢測技術可以檢測同一樣品中多種蛋白質磷酸化的狀態(tài)變化，并對其進行定量分析（使用對照和經(jīng)LY294002處理的Jurkat細胞的裂解物的p-AKT/p-GSK3b/p-cRaf的定量分析）。
 

一份樣品相近分子量靶點的檢測
 

利用RePlex技術表征了多種組織類型中AKT的磷酸化狀態(tài)。同一毛細管中檢測多種組織類型，包括肝，腎，結腸，腦，乳腺和肺中的panAKT和p-AKT。同時分析了不同組織中歸一化panAKT后，p-AKT信號的變化，即不同組織顯示出不同水平的AKT表達和磷酸化。
 

一份樣品多靶點的檢測

利用RePlex技術可以在第一輪免疫雜交中進行不同靶蛋白的測定，并在同一毛細管中進行第二輪總蛋白檢測。利用未經(jīng)處理和用人IGF1（hIGF1）處理過的MCF7細胞，第一輪檢測Pan AKT（NIR通道）和p-AKT（化學發(fā)光通道），第二輪檢測同一根毛細管中的總蛋白。結果顯示，利用Jess不同通道以及RePlex技術可以達到一份樣品獲取多個靶點的定量數(shù)據(jù)。
 

結論：

傳統(tǒng)Western Blot若從單個樣本中獲取更多的蛋白信息，即為了節(jié)省珍貴或昂貴的樣品，需要進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）。然而，眾所周知該技術會遭受不可預測的蛋白質損失，并且通常需要冗長的優(yōu)化以實現(xiàn)最佳的剝離效率并使蛋白質在印跡上的保留最大化。這使得幾乎不可能使用標準的條帶和探針技術進行任何定量分析。相比之下，Simple Western平臺Jess開發(fā)的RePlex技術是一種優(yōu)化的自動化兩步免疫分析，可以實現(xiàn)多個靶標的高效抗體去除和出色的目標蛋白在樣品毛細管中的保留，從而可以實現(xiàn)在一個樣品中獲得更多的蛋白信息。