一、牛冠狀病毒（BCoV）與 S 蛋白概述
牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus, BCoV）屬于冠狀病毒科 α 冠狀病毒屬，是引起牛腹瀉、呼吸道感染的重要病原。其表面刺突蛋白（Spike Protein, S 蛋白）是介導病毒感染、決定宿主嗜性的關鍵糖蛋白，也是疫苗研發和免疫應答的核心靶點。

二、S 蛋白的結構特征
1. 分子組成與構象

• 異源二聚體結構：S 蛋白由 S1（約 100-110 kDa）和 S2（約 50-60 kDa）亞基通過二硫鍵連接，形成三聚體錨定在病毒包膜上，整體呈棒狀突起。
• 功能分區： 
  • S1 亞基：N 端結構域（NTD）和 C 端受體結合域（RBD），RBD 負責識別宿主細胞表面的氨肽酶 N（APN）或唾液酸受體。
  • S2 亞基：包含融合肽（FP）、七肽重復區（HR1/HR2）和跨膜結構域（TM），介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合。

2. 糖基化修飾

• S 蛋白含 15-20 個 N - 糖基化位點，糖鏈覆蓋于蛋白表面，形成 “糖盾” 結構，可保護抗原表位、參與受體識別，并影響抗體結合效率。

三、分子量與序列特性

• 天然 S 蛋白：三聚體總分子量約 500-600 kDa，單體 S1+S2 約 150-170 kDa，糖基化后實際分子量略高于理論值（S1≈110 kDa，S2≈60 kDa）。
• 重組 S 蛋白：根據表達系統不同，分子量略有差異： 
  • 真核表達（桿狀病毒）：糖基化完整，分子量接近天然蛋白；
  • 原核表達（大腸桿菌）：無糖基化，S1 重組蛋白約 90 kDa，S2 約 50 kDa，需復性處理以恢復構象。

四、S 蛋白的生物學功能
1. 病毒感染啟動

• 受體結合：S1 亞基的 RBD 特異性結合牛腸上皮細胞表面的 APN 或唾液酸（α-2,3/α-2,6 連接），是宿主嗜性的決定因素。
• 膜融合介導：S2 亞基的 FP 在酸性內體環境中暴露，插入宿主膜，HR1 和 HR2 形成六聚體螺旋束，拉近病毒與宿主膜距離，促進融合。

2. 免疫原性與抗原變異

• 中和抗體靶點：S 蛋白是誘導中和抗體的主要抗原，關鍵表位位于 S1 的 RBD 和 S2 的 HR 區。
• 抗原漂移：S1 亞基的 RBD 和 NTD 易發生氨基酸突變（如牛呼吸道分離株與腸道株的 S 蛋白序列差異約 5%-10%），導致血清型多樣性和疫苗保護力下降。

五、重組 S 蛋白的表達與純化
1. 表達系統選擇 2. 純化工藝（以桿狀病毒系統為例）

• 收獲與澄清：收集昆蟲細胞培養上清，離心去除細胞碎片，0.22 μm 濾膜過濾。
• 親和層析：利用 S 蛋白 C 端 His-tag，通過 Ni-NTA 柱純化，200 mM 咪唑洗脫，純度達 80%-85%。
• 離子交換層析：根據 S 蛋白 pI 約 6.0-6.5，通過 SP Sepharose 柱（陽離子交換）在低鹽條件下結合，梯度 NaCl 洗脫，純度提升至 95%。
• 凝膠過濾：Superdex 200 柱去除聚集體，驗證三聚體結構（洗脫峰對應約 500 kDa）。

六、S 蛋白的應用與研究前沿
1. 診斷檢測

• ELISA 抗原：重組 S1 亞基作為包被抗原，檢測牛血清中的抗 BCoV 抗體，適用于腹瀉或呼吸道感染的流行病學調查。
• 中和試驗：利用重組 S 蛋白建立假病毒中和試驗（Pseudotype Neutralization Assay），評估血清中和活性，比傳統活病毒試驗更安全。

2. 疫苗開發

• 亞單位疫苗：桿狀病毒表達的 S 蛋白三聚體（含 S1+S2）與佐劑（如 Montanide）聯用，可誘導高效中和抗體，保護犢牛免受腹瀉攻擊。
• 病毒樣顆粒（VLP）：將 S 蛋白與 M、E 蛋白共表達，組裝成 VLP，模擬天然病毒結構，增強黏膜免疫和體液免疫。

3. 結構生物學研究

• 解析 S 蛋白與牛 APN 的共晶結構（如 RBD-APN 復合物），發現關鍵結合位點（如 S1 亞基第 479-485 位氨基酸），為設計小分子抑制劑提供靶點。

七、防控意義與挑戰

• 免疫程序優化：針對 S 蛋白的抗原變異，需定期更新疫苗株，或開發多價疫苗（如包含腸道株與呼吸道株 S 蛋白）。
• 跨物種傳播風險：BCoV 的 S 蛋白若獲得人型受體結合能力（如通過 RBD 突變），可能引發公共衛生關注，需持續監測其進化動態。

 

牛冠狀病毒 S 蛋白的結構與功能特性決定了病毒的感染機制和免疫逃逸能力。重組 S 蛋白的表達與純化技術為 BCoV 的診斷和疫苗研發提供了關鍵工具，而對 S 蛋白抗原表位變異和受體結合機制的深入研究，將推動更有效的防控策略開發，保障養牛業健康發展。