一，轉(zhuǎn)染攻略 — 4 種轉(zhuǎn)染方法比較

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如 DNA、RNA、蛋白質(zhì)等導(dǎo)入到真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著基因和蛋白功能的深入研究，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為科研實(shí)驗(yàn)中最常用的技術(shù)手段之一。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類：物理轉(zhuǎn)染法、化學(xué)轉(zhuǎn)染法及生物轉(zhuǎn)染法

理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。目前常用的轉(zhuǎn)染方法有陽離子聚合物轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和病毒感染，不同的轉(zhuǎn)染方法各有利弊，沒有一種轉(zhuǎn)染試劑是普遍適用的，我們需要依據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的轉(zhuǎn)染技術(shù)及轉(zhuǎn)染試劑，才有可能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 

二，轉(zhuǎn)染攻略 — 5 個(gè)問題全面解答

1. 細(xì)胞狀態(tài)

細(xì)胞狀態(tài)不好，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下，為確保良好的細(xì)胞狀態(tài)需注意以下幾點(diǎn)：

a. 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞解凍后傳代 3～4 次；

b. 使用活性 > 90% 的細(xì)胞,可通過臺(tái)盼藍(lán)染色等測(cè)定細(xì)胞活性；

c. 定期傳代細(xì)胞，切勿讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)或過度生長，多數(shù)情況下，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 60%～80% 時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。

2.使用優(yōu)質(zhì) DNA

為實(shí)現(xiàn)高效率、低毒性的轉(zhuǎn)染，應(yīng)使用高質(zhì)量的 DNA（高純度、無菌、無內(nèi)毒素）。

a. 使用無內(nèi)毒素的試劑盒和實(shí)驗(yàn)方案制備 DNA；

b. 測(cè)定 DNA 純度，OD 260/280 值應(yīng)介于 1.7～1.9 之間，越接近 1.8 越好；

c. 使用無 DNA/RNA 酶的水或 TE 稀釋 DNA。

3.載體構(gòu)建

若質(zhì)粒基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒害作用，則轉(zhuǎn)染難以成功。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建選擇可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子很重要，可以以空載體或相同載體的其他基因?yàn)閷?duì)照排除毒性對(duì)細(xì)胞的影響。

4.優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑/DNA 的比例

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適濃度的 DNA，調(diào)整 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例，以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

5.防止污染

細(xì)胞污染也會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下，為防止細(xì)胞污染應(yīng)注意：

a. 培養(yǎng)物污染

培養(yǎng)物可被細(xì)菌、真菌、病毒、支原體或其他細(xì)胞種類所污染，各種污染均會(huì)導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤。

b. 支原體污染

支原體污染一般難以察覺，培養(yǎng)的細(xì)胞被支原體污染后，幾乎可以改變細(xì)胞的所有功能，包括酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。因此，必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。

c. 交叉污染

三，轉(zhuǎn)染攻略 — 2 個(gè)方法助力效率驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染完成后需要對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證，常用的轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證方法有以下兩種：

1、利用含 GFP 或 RFP 之類報(bào)告基因的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可以測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和 GFP 蛋白表達(dá)細(xì)胞的百分比。

a. 轉(zhuǎn)染后 24～48 小時(shí)，即可以檢測(cè)到質(zhì)粒的表達(dá)。

b. 陽性對(duì)照可以放在一個(gè)單獨(dú)的孔中，或是與目的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。

2、利用 qPCR 法精確定量目的基因。