鱟血變形細胞裂解物的制備步驟與制品檢測步驟介紹
一、材料與制備
1、鱟
采用我國東南沿海地區(qū)的鱟即東方鱟（中國鱟），采血量最多為400ml，平均200ml（需根據(jù)體重大小而定），其變形細胞數(shù)最高為5×1011/L以上，平均為4×1010/L。
2、器材及處理
準備采血瓶（250ml玻璃瓶）注射器等用具，經(jīng)洗滌后放在重鉻酸鉀與硫酸的清潔液中浸泡過夜，然后用無內(nèi)毒素的流水沖洗3次，晾干后于260℃烤箱內(nèi)烘干3h備用。采血針、管均需用一次性無菌采血器（均無內(nèi)毒素）。
3、試劑配制
以下試劑中凡是固體試劑均需預先去除內(nèi)毒素，去內(nèi)毒素的方法要視各種試劑的耐熱度而定，一般用80~120℃不間斷烘烤約10h左右。配制試劑用的重蒸餾水應不含內(nèi)毒素（小于0.03EU/ml內(nèi)毒素含量）。
- 抗凝劑1：茶堿（theophylline）2g；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2g；氯化鈉40g；無內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。
- 抗凝劑2：茶堿0.36g；磷酸氫二鈉2g；氯化鈉4g；無內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。
（3）洗滌液：磷酸氫二鈉2g；氯化鈉40g；無內(nèi)毒素蒸餾水1000ml。
（4）裂解液：將0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷（Tris）用鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為7左右，也可加入二價陽離子如Ca2+、Mg2+、Mn2+等提高靈敏度。
二、制備步驟
1、采血
取活鱟用水沖洗，將鱟屈曲，露出頭、胸、腹三節(jié)交界處，用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G針頭一次性輸血器，針尖插入盛有100ml抗凝劑1的瓶中，另一端的針頭刺入鱟的頭腹部關節(jié)處深入約1～2cm，藍色血液就流入瓶內(nèi)，每瓶采血100ml，注意穩(wěn)定針頭，使其不要移動。在采血過程中，鱟血應是順暢地流入瓶中，若發(fā)生間歇滴入就容易凝固，應即棄去不用。采血后立即用1000r/min離心約2min。離心后，變形細胞沉積于瓶底，呈白色，此時棄去上層藍色血液即可。
2、洗滌
用抗凝劑2-20ml加入瓶中輕輕搖晃，使沉淀的變形細胞均勻地分散混懸于抗凝劑中，然后以1000r/min離心1min。棄去上清液后用4%氯化鈉磷酸鹽溶液洗滌3次，之后再次離心約1500r/min 1min，將細胞壓實，棄去上清液。
3、裂解
將壓實的變形細胞加入約3倍裂解液后使細胞計數(shù)在5×1011/L，變形細胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱內(nèi)，每天震蕩2次，以使細胞裂解完全。析出的液體應透明無色。
4、分裝凍干
將裂解物以3000r/min離心15min，收集上清液分裝于安瓻中，放置于醫(yī)用冷凍干燥機中，-30℃快速冷凍，然后于真空狀態(tài)下升溫干燥，升溫不超過20℃。冷凍干燥后即可得到標準靈敏度的鱟試劑成品。
三、制品檢測
1、使用凝膠法進行鱟試劑成品內(nèi)毒素測定，標準內(nèi)毒素含量為10EU/支，準確加λ無內(nèi)毒素用水（以下簡稱水）1.0ml，溶解，用封口膜封住安瓿口。
2、將封口安瓿放λ旋渦混合器上旋渦混合，一般情況下國家標準品是20~30min，工作標準品是10~15min（其要求的理由下述會闡明）混合時注意不要使安瓿內(nèi)溶液沾上封口材料。
3、將混合好的內(nèi)毒素溶液（此時濃度為10EU/ml）用水稀釋為2λ、λ、0.5λ及0.25λ濃度的系列濃度（λ為靈敏度），即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml濃度的系列溶液。
4、操作方法：①取20支無內(nèi)毒素試管分為4組，每組分別標記上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0（空白管陰性對照）。②分別吸取鱟試劑0.1ml 加入E0至E1的對應試管。③E0管加入0.1ml水，其余各管加入0. 1ml與管上標注數(shù)字相同濃度的標準內(nèi)毒素。④用封口膜封閉試管，將試管內(nèi)容物輕輕搖勻。⑤把試管架放入37±2℃的恒溫水浴中保溫60±2min。在保溫過程中不能有任何震動，以免影響反應的正常進行。保溫時間結束后將試管取出觀察結果，注意，E0管需保溫至4h才取出觀察結果。⑥實驗結果判斷：將試管緩慢翻轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)凝膠顯示堅實不變形為陽性，記錄為“+”；若無凝膠出現(xiàn)﹐或疑有凝膠但不能保持完整，從管壁滑脫，均判為“陰性”，記錄為“－”。
