上周四，賽業生物生產中心負責人蘇翠主講的「小鼠基因型鑒定的策略及常見問題」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:
1.鑒定基因型有時候擴出很多弱的雜帶怎么辦？
2.同一個小鼠的一個基因位點鑒定不出來，其他基因都可以鑒定出來？
3.如果人源化小鼠的插入位點是未知的，該如何設計引物進行鑒定呢?
4.PCR循環數應該怎么選擇呢？
5.PCR條帶為150bp以下，電泳條帶非常模糊，有什么好的方法嗎？

Q 鑒定基因型有時候擴出很多弱的雜帶怎么辦？
A PCR擴增過程中產生非特異條帶，一般與引物的特異性、退火溫度、延申溫度、循環數量過多有關。

1、引物特異性可以用NCBI “Primer-BLAST”進行分析，確定除了目的序列無其他結合位點；

2、設置PCR程序梯度反應，摸索出最佳退火溫度；

3、確定聚合酶的延伸溫度，不同品牌的聚合酶有不同的延伸溫度，要詳細咨詢廠家技術；

4、循環數適當降低，比如開始是35個循環，可以調低至30個循環。

Q 同一個小鼠的一個基因位點鑒定不出來，其他基因都可以鑒定出來？
A 若同一個樣品的DNA模板，其中一個基因位點擴增不出目的條帶，其他基因位點都能擴出，說明這個樣品可能是個多基因修飾的模型組織DNA。

1、需要確定是否為多基因都修飾成功了。比如親本是多基因修飾模型，在繁育過程中后代基因會分離和隨機組合，不一定同時攜帶了多個修飾位點；

2、其次，如樣品確定是攜帶多基因修飾的，其他基因能擴出來，證明DNA模板沒有問題，可能是以下兩個原因：

（1）另一個基因位點的擴增引物不適，比如引物降解了、設計不合理等，如果是之前鑒定過沒有問題的引物，那直接安排重新合成即可；若沒有擴增過，可以返回查看引物序列是否合理，有問題需重新設計；

（2）該基因序列相對其他基因較復雜，比如高GC、低GC、序列重復等，需要對PCR程序調整，可用touchdown提高擴增效率或梯度摸索最佳退火溫度；同時選用其他擴增效率更高的聚合酶；PCR體系中根據序列特殊性增加DMSO、Mg2+等。

Q 如果人源化小鼠的插入位點是未知的，該如何設計引物進行鑒定呢?
A 如果人源化小鼠的插入位點未知，那猜測是個轉基因過表達模型。插入的位點未知，但插入的人源化序列是已知的，可以將引物設計在人源化序列上：

1、常規PCR方法只能區分陽性和陰性，無法區分純雜合；

2、如果是基因組人源化，設計引物時需要考慮人源序列與鼠源序列的同源性，將引物設計在非同源的人源序列區域，并且將設計好的引物在NCBI “Primer-BLAST”分析，在鼠源基因組上沒有結合位點，只結合人源序列；

3、如果是人源CDS過表達，有引入外源啟動子等調控元件，優先將引物設計在外源元件上，如CAG啟動或者polyA上；因此人源化小鼠樣品能擴出陽性條帶，野生型小鼠無法條帶。

Q PCR循環數應該怎么選擇呢？
A 根據模板的類型和擴增的目的來區分，且根據實際擴增結果微調，一般規則如下：
1、判斷基因型為陽性還是陰性：只需通過跑電泳宏觀分析條帶大小，一般循環33~38個；

2、擴增的目的條帶需要回收用于測序：PCR條帶要求亮，產物回收量有要求，循環設置在35~38個；

3、擴增的目的條帶需要回收用于質粒克隆：擴增的PCR產物保真性要求高，不能有突變或缺失，因此用高保真聚合酶，循環一般27~30個循環；

4、以小鼠基因組DNA作為模板：基因組擴增相對質粒更難，模板DNA要求在50~100ng，常用的循環數33~38個；

5、以質粒DNA作為模板：擴增簡單，質粒DNA拷貝數高，模板要求小于1pg，常用循環數25~30個。

Q PCR條帶為150bp以下，電泳條帶非常模糊，有什么好的方法嗎？
A
1、使用TBE電泳緩沖液，相較于TAE，TBE更合適分離小分子DNA片段；

2、瓊脂糖凝膠濃度用3%；

3、只用一排制膠梳子，可用電泳跑道距離足夠大，防止染料擴散快導致DNA條帶不夠亮：DNA帶負電，在電泳中的遷移方向是從負極-正極，染料帶正電，方向是由正極-負極；

4、電泳時，電壓降低，4V/cm，若一個20cm的電泳槽，電壓可設置為80V。