感染高危型人乳頭瘤病毒(HPV)導致全世界5%的癌癥，包括宮頸癌和口咽癌。HPV16占大多數(shù)，并且持續(xù)的角質形成細胞感染是主要的危險因素。病毒癌基因在人類致癌中的作用已經(jīng)被深入研究了幾十年，分化對病毒生命周期的重要性是已知的。病毒的生命周期依賴于復層鱗狀上皮的分化程序，但支持病毒生命周期不同階段的角質形成細胞亞群的格局尚未闡明。在2023年4月，發(fā)表在Nature Communications上的“Single cell transcriptomic analysis of HPV16-infected epithelium identifies a keratinocyte subpopulation implicated in cancer”一文（中文題目：HPV16感染上皮的單細胞轉錄分析確定與癌癥有關的角質形成細胞亞群）中，研究者構建類器官并進行單細胞測序共識別出12個不同的角質形成細胞群，其中一個亞群被映射以重建它們在復層鱗狀上皮中各自的三維位置。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的終末分化細胞不同，HPV重新編程的角質形成細胞亞群(HIDDEN細胞)形成了表面區(qū)域，并需要ELF3/ESE-1轉錄因子的過度表達。
 

Visual summary

 

技術路線

 

研究內(nèi)容

1. scRNAseq 揭示了 HPV16+ 與 HPV16− 復層鱗狀上皮raft中不同角質形成細胞亞群的富集

研究者首先從HPV+ 和 HPV- 靠近形成皮膚的二倍體永生化角質形成細胞 (NIKS)構建了3D類器官raft，隨后研究者對構建成功的HPV+ raft和 HPV- raft進行了單細胞測序，形成了12個角質形成細胞亞群(C0-C11)。其中C9 與其余 11 個簇唯一分離，并且在 HPV16+ 細胞中高度富集，3個簇 (C4、C5 和 C7) 富含 HPV16- 細胞，除 C9 外，C6 亞群也富含 HPV16+ rafts，而 C8 亞群只存在于 HPV16+ rafts中。

圖1 HPV16+ raft與HPV16- raft的產(chǎn)生
 

圖2 HPV16+ raft與HPV16- raft單細胞測序分群展示

 

2. 角質形成細胞亞群主要由分層鱗狀上皮的分化程序來定義

研究者進行了擬時序分析發(fā)現(xiàn)，除了C9，其他所有角質形成細胞亞群都沿著鱗狀上皮分化程序連續(xù)排列。依據(jù)基因表達特征，細胞亞群也顯示出基底細胞（C10、C7、C6、C4 和 C5）或分化細胞特征（C1、C8、C0、C11、C2 和C3)。IHC 染色檢查 HPV16- 和 HPV16+  raft中特異性標記物的蛋白質表達顯示也與之前一致。然而，值得注意的是，HPV16+ 上皮細胞的分化標記物染色強度較低，表明 HPV 重編程抑制了正常的分化程序，特別是在上皮細胞的最上層。、
 

圖3 擬時序分析使細胞沿著三維分層上皮的分化程序排列

 

3. 基底上細胞簇的空間映射揭示了 HPV16+ raft中尚未描述的上皮區(qū)域

由于scRNA-seq不能識別空間位置信息，因此研究者使用 RNA-ISH來定位選定的角質形成細胞亞群。鑒于在基底上HPV+ vs HPV- raft中觀察到的差異蛋白染色，最上面的分化亞群特別令人感興趣。他們假設地理分布的差異可能反映了HPV 的轉錄重編程，并且也是圖 3f 中觀察到的蛋白質水平變化的基礎。為此，C3被確定為最終末分化的細胞亞群。

之后研究者依據(jù)自己的篩選標準試圖識別“聚類定義基因”，這些基因可以作為生物標志物，獨立地表示聚類。他們確定了用于C2（C10orf99 和 DSG1）和C3（KLK7、SPRR1A、RDH12 和 POF1B）兩個群中的基因。接下來，研究者發(fā)現(xiàn)終末分化的 C2 和 C3 角質形成細胞亞群在亞匯合單層培養(yǎng)物中基本上不存在，并且它們的形成需要上皮分化程序。RNA-ISH空間映射和C3生物標志物KLK7用于定位raft中的這種分化亞群。他們發(fā)現(xiàn)KLK7在 HPV+ 與 HPV- rafts 中的定位具有差異，表明HPV16+ rafts中基底上簇的失調。雖然KLK7+ C3細胞位于HPV16- rafts的最上層，但HPV16+ rafts在KLK7+細胞上方還有一個額外的區(qū)域（紅標記線，圖 4e）。
 

圖4 分層鱗狀上皮中終末分化的 KLK7+ C3 角質形成細胞亞群的空間定位

 

4. C9轉錄組定義了一個分化不協(xié)調的角質形成細胞亞群，該亞群形成了HPV16+raft的最上層

研究者識別并可視化了C9簇的生物標記物，包括ELF3、GPR110和Lcn2。相對于未分化（亞融合）細胞，C9 細胞標志物的表達在分化模型（過度融合細胞和raft）中增加。因此它仍然依賴于分化程序，研究者決定在復層上皮模型中進行研究。研究者用C9 簇標記物的 RNA-ISH 將這個群體定位到最上層的基底上區(qū)域，在 HPV16+ raft的許多細胞中具有強烈的染色。IF顯示ELF3 和 LCN2 蛋白定位于 HPV16+ rafts 的最上層區(qū)域，而在 HPV16- rafts 中基本不存在。之后研究者應用通路分析和轉錄因子分析顯示病毒發(fā)病機制和鱗狀細胞分化的重要性。為了捕捉 C9 轉錄組的這些特征，他們將 C9 亞群稱為 HPV 誘導的分化不協(xié)調上皮非常規(guī) (HIDDEN) 細胞。

 

圖5 C9細胞占據(jù)HPV16+上皮的淺表細胞層

 

5. HPV+宮頸raft中HIDDEN細胞上調

研究者使用了由原代宮頸角質形成細胞設計的器官型上皮raft（感染了HPV18的HPV+和HPV-）。通過 RNA-ISH和 IF檢測到許多強烈染色的 ELF3+ 基底上細胞。這表明 (1) 在健康宮頸上皮細胞的基線觀察到很少的 ELF3+ 細胞，(2) HIDDEN 細胞在宮頸上皮細胞中被 HPV 高度上調，以及 (3) 其他高危 HPV 類型如 HPV18 也誘導 HIDDEN細胞區(qū)域。

 

6. 在HPV驅動的宮頸癌發(fā)生的各個階段都檢測到HIDDEN細胞

研究者試圖評估在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的不同階段。一般來說，CIN1病灶包含病毒片段，而CIN2和CIN3含有片段和整合的病毒基因組，存在異常增生并發(fā)展為宮頸鱗狀細胞癌（SCC）。研究者收集、處理和篩查疑似宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的宮頸活檢組織中的高危HPV標志物p16。隨后IF染色以尋找HIDDEN細胞生物標記物ELF3。結果顯示：ELF3蛋白在正常宮頸外上皮組織中低表達或檢測不到。但p16+基底細胞上方的組織顯示出ELF3的強烈染色。這包括具有 HPV 特征和 CIN 病變的組織，無論等級如何。在具有 CIN 病變的組織的某些區(qū)域中，觀察到 ELF3 染色在中間區(qū)域中更強烈，而在更淺表的細胞中染色強度較低（CIN1）。盡管如此，在所有 p16+ 組織中，HIDDEN 細胞都得到了極大的擴增。
 

圖6 在HPV陽性宮頸raft和宮頸癌前病變中檢測到HIDDEN細胞
 

7. HIDDEN細胞生物標志物在HPV+SCC腫瘤中升高

由于發(fā)現(xiàn) HIDDEN 細胞持續(xù)存在于癌前宮頸組織 (CIN1-3) 的所有階段，研究者提出 HIDDEN 細胞從癌前病變進一步持續(xù)存在到惡性鱗狀細胞癌中。因此研究者分析了 PanCancer TCGA 以確定癌癥中HIDDEN細胞生物標志物的表達。在可供分析的 488 名 HNSCC 患者中，與其余患者相比，9% 的 ELF3 表達顯著升高 (z ≥ 2.0)。重要的是，該患者亞組在 HPV 狀態(tài)、國際疾病分類 (ICD)-10 分類（指示解剖位置）、染色體 1q 異常和缺氧評分方面具有統(tǒng)計學顯著差異。接下來研究者在HPV+ vs HPV- HNSCC 中探究了ELF3 的表達，也檢測了按 ICD-10 分組的 HNSCC 中的 ELF3 mRNA 的水平。以上結果支持在 HPV+ 疾病過程（包括癌癥）中存在 ELF3 驅動的分化鱗狀細胞亞群。

隨后研究者使用TCGA 數(shù)據(jù)集中的大型 HNSCC 和宮頸 SCC 患者隊列改進 HIDDEN 細胞轉錄組，以識別強有力的共生生物標志物，用于檢測 SCC 中的類似群體。
 

圖7 ELF3 依賴性 C9 細胞群與 HPV+ 頭頸和宮頸 SCC 相關

 

8. 在已發(fā)表的 HNSCC scRNAseq 數(shù)據(jù)中檢測到 HPV+HIDDEN 細胞特征

為了在獨立數(shù)據(jù)集中驗證上述特征，研究者分析了9個 HPV- 和6個 HPV+HNSCC 腫瘤的已發(fā)表 scRNAseq 數(shù)據(jù)，并證實了 HIDDEN 細胞的存在且在HPV+中增加。
 

圖8 在HPV+和HPV - HNSCC scRNAseq數(shù)據(jù)中檢測到HIDDEN細胞

 

9. HIDDEN細胞在HPV+扁桃體raft和HPV+HNSCC患者活檢組織中富集

研究者檢查了HPV 感染和轉化的頭頸部組織中HIDDEN細胞是否存在。初級扁桃體上皮被用作口咽部 HPV 感染的模型。研究者通過檢測HPV+和HPV -raft中 ELF3 和 GPR110發(fā)現(xiàn) HPV+中HIDDEN 細胞顯著上調。研究者也對 HNSCC 患者活組織進行了同樣檢查并具有同樣發(fā)現(xiàn)。
 

圖9 在 HPV+ 扁桃體衍生的上皮細胞和 HNSCC 患者活檢組織中檢測到HIDDEN細胞

 

10. ELF3 敲低抑制HPV16+上皮raft中的HIDDEN細胞

研究者在 HPV16+ NIKS 中敲低ELF3并用于生成raft。結果顯示，ELF3 敲低幾乎完全消除了 HPV+ raft最上層區(qū)域中的 ELF3+ HIDDEN 細胞，且HIDDEN 上皮亞群中與 ELF3 共表達的基因表達減少。這些數(shù)據(jù)表明，ELF3轉錄因子是分層 HPV16 感染上皮中基底上層HIDDEN細胞區(qū)室的形成和/或維持所必需的。
 

圖10 HIDDEN 細胞區(qū)需要 ELF3 表達

 

主要結論

1. 報告了高危 HPV 感染的分層上皮細胞的轉錄組學景觀；

2. 發(fā)現(xiàn)了形成隔室并有可能標記 HPV 感染組織表面的上皮HIDDEN細胞；

3. 鑒定了 ELF3作為 HIDDEN 區(qū)域所需的 HPV 誘導轉錄驅動因子；

4. 檢測 HPV+ SCC 中的 HIDDEN 細胞富集并與預后不良相關聯(lián)。