近日，華中農業大學水產學院高澤霞教授研究團隊聯合中國科學院南海海洋研究所林強研究員團隊的研究成果“Single-cell transcriptomes and runx2b−/− mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish（單細胞轉錄組和runx2b−/− 突變體揭示斑馬魚肌間刺形成的遺傳特征）在雜志National Science Review（IF：23.178）上發表。平生公司的離活一體Micro CT（型號：NEMO）在論文中提供了重要的斑馬魚圖像和定量分析。

該研究水產學院博士后聶春紅、副教授萬世明、博士生陳宇龍為論文共同第一作者， 水產學院高澤霞教授和中國科學院南海海洋研究所林強研究員為論文共同通訊作者， 水產學院王衛民教授參與指導了本研究。

文獻摘要：

肌間刺（IBs）是存在于肌膈間的礦化的硬骨小骨，僅存在低等真骨魚類中。肌間刺一般較小且尖銳，限制了魚的加工方式，如果卡在消費者的喉嚨或口腔中，會造成傷害或創傷，從而影響魚對許多消費者的吸引力。硬骨魚類中肌間刺的發生發育還沒有充分了解以及肌間刺形成分子基礎仍有待進一步研究。因此，該研究首先利用單細胞轉錄組測序技術（scRNA-seq）定義了野生型斑馬魚肌間刺所在區域的18個細胞類群，篩選到了肌間刺形成顯著相關的肌腱祖細胞、肌腱分化細胞、成熟肌腱細胞和成骨細胞類群。細胞擬時序分析結果推測肌間刺是由肌腱祖細胞經肌腱分化細胞，再分化為成骨細胞而形成的。根據基因在細胞軌跡上的表達模式，篩選到10個與肌間刺形成密切相關的功能基因，并在斑馬魚上運用CRISPR-Cas9基因編輯技術分別構建了基因突變品系。最終發現runx2b突變斑馬魚肌間刺完全缺失，且其個體生長、其它骨骼單元形成、肌肉脂肪酸和氨基酸含量等性狀均未受到顯著影響。scRNA-seq分析同時揭示了runx2b突變體斑馬魚的肌間刺發生區成骨細胞數量的顯著減少，在個體和細胞水平明確了TGF-β/BMP signaling pathway在肌間刺形成過程中的重要調控作用。本研究為runx2b調節肌間刺形成的關鍵作用提供了證據。遺傳育種可以針對runx2b調節并創制沒有肌間刺的商業魚類品種，這可以提高許多養殖魚類品種的安全消費和經濟價值。

實驗方法：

用MS-222對4個月大的runx2b-/-和runx2b+/+斑馬魚實施安樂死，并在4% PFA溶液中固定24小時。共7條魚樣本(4條runx2b+/+， 3條runx2b-/-)使用微計算機斷層掃描(μCT) (NEMO®Micro CT, 平生醫療科技有限公司)，體素大小為6μm(使用90kv 電壓，0.06 mA電流)。圖像重建使用Avatar軟件。利于半自動閾值選取脂肪（-200＜CT值≤-80）和肌肉（-80＜CT值≤280）。利用FDK算法，通過三維重建軟件量化脂肪和肌肉的體積。利用標準骨密度模型校準后測量斑馬魚骨密度。為了鑒定上述runx2b+/+和runx2b-/-斑馬魚的肌間刺表型，作者掃描了斑馬魚脊柱的9-13和19-23區域(從頭到尾)。runx2b+/+斑馬魚體內可以清晰地觀察到肌間刺，而runx2b-/-斑馬魚體內則看不到肌間刺(圖5C)。為了保證數據的準確性，在相同掃描條件下對一條完整的斑馬魚進行了兩次掃描。

實驗結果：

圖3 runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的基因結構和表型特征。C 6μm以下分辨率的Micro-CT掃描顯示runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的整體骨骼結構。對椎體9-14和19-23區域進行分辨率低于4μm的CT掃描，以顯示IBs的細節

圖4比較runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚的游動性、組織和生長特征 (A, B) runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚6種不同骨組織礦物質密度(TMD)值。(C, D) runx2b+/+和runx2b−/−斑馬魚肌肉體積的定量;紅色和綠色區域分別表示肌肉和脂肪

使用設備：

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫療科技）