在生豬養(yǎng)殖過程中，宮內(nèi)生長受限（IUGR）會導(dǎo)致仔豬低出生體重（LBW）以及繼發(fā)的哺乳期高死亡率和全期低生長性能，此前有研究表明，IUGR導(dǎo)致的仔豬LBW與出生后腸道炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。然而，關(guān)于LBW導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚。

2023年1月，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王軍軍教授與團隊在Microbiome（IF=16.874）期刊在線發(fā)表題為“Gut microbiota-derived ursodeoxycholic acid alleviates low birth weight‑induced colonic inflammation by enhancing M2 macrophage polarization”的論文，該研究綜合運用膽汁酸譜靶向定量代謝組和微生物組學(xué)技術(shù)、糞菌移植和巨噬細胞清除等研究方法，揭示了一種膽汁酸（BAs）—熊脫氧膽酸（UDCA）通過與BAs受體法尼醇受體（FXR）結(jié)合、抑制巨噬細胞中NF-κB信號通路的活化，從而減少腸道炎性細胞因子的產(chǎn)生，以緩解IUGR豬腸道損傷的分子機制。（麥特繪譜提供膽汁酸譜靶向定量檢測分析服務(wù)）

1. 膽汁酸譜分析

收集出生后第2天正常體重仔豬（NBW）和LBW仔豬糞便樣本進行膽汁酸譜靶向定量分析，結(jié)果顯示NBW組中大部分BAs（75%）濃度高于LBW組，其中以豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）和UDCA為仔豬糞便主要BAs。與NBW組相比，LBW組初級、次級和總BAs濃度顯著降低，主要有UDCA、HDCA、HCA、CDCA、7-Keto LCA和βUDCA。

圖1. LBW與NBW仔豬糞便膽汁酸代謝差異分析

2. 糞菌移植試驗（FMT）

用LBW仔豬和NBW仔豬的糞便制備糞菌，移植到無菌小鼠體內(nèi)。24天后顯示，與NBW-FMT小鼠相比，LBW-FMT小鼠體重顯著降低，結(jié)腸炎癥因子(IL-1β和TNF-α)的表達顯著上調(diào)，粘蛋白-2 (MUC2)和BA受體(FXR)的表達顯著下調(diào)。隨后分別對兩組仔豬的糞便和兩組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物進行16S rRNA分析，結(jié)果顯示兩組仔豬之間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，兩組FMT小鼠亦然。屬水平上，LBW仔豬的Bacteroides, Lactobacillus和Veillonella豐度較高，Escherichia-Shigella, Clostridium sensu stricto 2和Enterococcus豐度較低；而LBW-FMT小鼠Lactobacillus和 Enterorhabdus豐度較高，Akkermansia和Bacteroides豐度較低。這表明，FMT后小鼠腸道菌群模式與供體仔豬不同，提示微生物功能可能是引起LBW仔豬腸道炎癥的關(guān)鍵因素。

圖2. FMT對腸道微生物組成和腸道健康的影響

功能分析顯示，LBW仔豬的初級BA合成和次級BA合成功能發(fā)生改變。與NBW相比，LBW仔豬攜帶7α-羥基甾體脫氫酶(7α-HSDH)基因的細菌顯著減少，而BA 7-去羥基化(baiJ)活性細菌顯著增加。攜帶7α-HSDH基因的細菌豐度在LBW-FMT小鼠中也顯著降低。此外，LBW仔豬中所有參與CDCA合成UDCA的BAs和微生物酶都顯著減少。

上述結(jié)果說明LBW仔豬微生物膽汁酸代謝發(fā)生顯著變化。進一步分析FMT小鼠膽汁酸譜，結(jié)果與仔豬相似，LBW-FMT組初級、次級和總BAs濃度顯著降低，主要有UDCA、HCA和12-DHCA。此外，7α-HSDH和7β-HSDH的基因拷貝數(shù)與結(jié)腸中UDCA濃度顯著相關(guān)，炎癥因子(IL-1β和TNF-α)的表達水平與結(jié)腸中UDCA濃度呈負相關(guān)。因此，LBW仔豬的表型可通過種間FMT進行再現(xiàn)，且LBW仔豬的BA代謝和腸道炎癥均與腸道微生物組有關(guān)。

圖3.  LBW與NBW兩組分別FMT小鼠膽汁酸譜分析

3. UDCA的體內(nèi)功能分析

基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員進一步探究UDCA是否會直接預(yù)防腸道炎癥和腸屏障功能障礙。給DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型口服UDCA，分析發(fā)現(xiàn)，UDCA處理顯著改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎（檢測指標：小鼠體重、疾病活動指數(shù)評分、結(jié)腸長度、髓過氧物酶MPO以及炎癥細胞浸潤、上皮層破壞、杯狀細胞數(shù)量、促炎細胞因子表達、BA受體FXR和TGR5的表達）。

隨后，研究人員利用LBW仔豬驗證添加UDCA是否有相似作用。給新生LBW仔豬口服UDCA 7天（50 mg/kg/d），結(jié)果顯示，第8天的體重顯著高于對照組，并且UDCA明顯改善了粘膜上皮的完整性，增加了結(jié)腸中組織學(xué)評分顯著降低的杯狀細胞的頻率，促炎因子(IL-1β和TNF-α)表達水平降低。提示UDCA可能具有改善LBW仔豬腸道健康和產(chǎn)后發(fā)育的臨床實用價值。

圖4. 口服UDCA減輕LBW仔豬結(jié)腸炎癥

4. UDCA作用機制探究

由于巨噬細胞在結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中非常關(guān)鍵，研究人員隨后評估巨噬細胞在UDCA介導(dǎo)的結(jié)腸炎和腸道炎癥緩解中的作用。給小鼠DSS處理的小鼠（添加或不添加UDCA）腹腔注射含氯膦酸脂質(zhì)體，巨噬細胞消失（如下圖）。分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的耗竭消除了UDCA對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的緩解以及UDCA介導(dǎo)的DSS處理小鼠結(jié)腸中IL-1β和TNF-α的抑制。進一步利用LBW-FMT小鼠得到了證實，即UDCA在結(jié)腸中發(fā)揮抗炎作用主要是受巨噬細胞的調(diào)控。對巨噬細胞極化分析顯示，DSS處理導(dǎo)致MI巨噬細胞（炎性）百分比增加，M2巨噬細胞（抗炎）減少，而UDCA給藥逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。這表明UDCA至少部分通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化發(fā)揮抗炎作用。

圖5. 巨噬細胞耗竭對UDCA介導(dǎo)的DSS引起的小鼠腸道炎癥緩解的影響

NF-κB和MAPK信號通路是促炎細胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵通路。DSS處理的小鼠結(jié)腸中檢測發(fā)現(xiàn)UDCA在NF-κB和MAPK通路激活中的作用。UDCA處理后p65 NF-κB磷酸化顯著降低，而在DSS或UDCA處理中，未觀察到MAPK (p38, JNK和ERK)信號通路的顯著差異。進一步轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，在LPS刺激的J774A.1細胞中，UDCA導(dǎo)致1948個基因顯著上調(diào)，2099個基因顯著下調(diào)，包括TNF信號通路、細胞因子受體相互作用、toll樣受體信號通路和NF-κB信號通路在內(nèi)的多條差異通路下調(diào)。

另外，F(xiàn)XR和TGR5如何介導(dǎo)UDCA的抗炎反應(yīng)呢？分析發(fā)現(xiàn)，LPS處理的J774A.1細胞中，UDCA誘導(dǎo)了FXR，增加了FXR的蛋白表達。通過FXR siRNA干擾后，F(xiàn)XR表達明顯下調(diào)；LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化被UDCA抑制；而使用FXR特異性siRNA敲除FXR部分消除了這種抑制作用。此外，F(xiàn)XR的下調(diào)也部分逆轉(zhuǎn)了UDCA介導(dǎo)的IL-1β表達的抑制，并完全恢復(fù)了TNF-α的表達。這些結(jié)果表明，FXR參與了UDCA介導(dǎo)的LPS誘導(dǎo)的NF-κB激活和促炎細胞因子產(chǎn)生的抑制。

圖6. FXR參與UDCA介導(dǎo)的LPS處理的J774A.1細胞抗炎作用

小結(jié)

本研究建立了LBW仔豬腸道炎癥與腸道微生態(tài)失調(diào)，尤其是膽汁酸代謝異常之間的因果關(guān)系，并從巨噬細胞分型調(diào)控的角度揭示了關(guān)鍵膽汁酸UDCA的作用機制，為通過靶向腸道微生物和膽汁酸代謝調(diào)控改善LBW新生仔豬發(fā)育和腸道健康進行營養(yǎng)干預(yù)措施提供了理論依據(jù)。

參考文獻

Pi et al., Gut microbiota-derived ursodeoxycholic acid alleviates low birth weigh-induced colonic inflammation by enhancing M2 macrophage Polarization. Microbiome. 2023.

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本研究糞便膽汁酸靶向定量代謝組由麥特繪譜提供檢測服務(wù)。膽汁酸作為一類具有特殊生理作用的小分子，近年來被證實參與機體糖類、脂肪代謝等重要的生理生化過程，并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。針對膽汁酸譜，麥特繪譜擁有兩套絕對定量檢測方法：膽汁酸簡譜和65+種膽汁酸全譜。目前已協(xié)助客戶在Cell Metabolism, Diabetes Care, Nature Communications, Advanced Science, Science Advances, Microbiome等國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表40余篇膽汁酸相關(guān)研究成果，平均IF>9。

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