用鈣黃綠素紅鈉鹽進行活細胞功能檢測的實驗方案及步驟
1、鈣黃綠素紅鈉鹽實驗方案
AM酯是非極性酯，很容易穿過活細胞膜，并被活細胞內(nèi)的細胞酯酶迅速水解。AM酯被廣泛用于無創(chuàng)地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須特別注意，因為它們易于水解，特別是在溶液中。在使用高質(zhì)量無水二甲基亞砜（DMSO）之前，應將其重新配制。DMSO儲備溶液可在-20°C的環(huán)境中干燥保存，并避光。在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。該協(xié)議僅提供指南，應根據(jù)您的特定需求進行修改。
1）.準備2至5 mM的AM酯高品質(zhì)無水DMSO儲備溶液。非離子型洗滌劑F-127有時用于增加AM酯的水溶性。
注：20％的Pluronic等體積® F-127溶液可以稀釋到裝載緩沖器之前加入到細胞活力指標DMSO儲備溶液。終的Pluronic ® F-127的濃度為約0.02％。
2）.在實驗當天，將細胞活力的固體指示劑溶解在DMSO中，或?qū)⒅甘緞﹥淙芤旱牡确衷嚇咏鈨鲋潦覝亍Ｔ谀x擇的緩沖液（例如Hanks和Hepes緩沖液）中準備1至10 µM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，建議終濃度為4至5 µM的細胞活力指標。必須根據(jù)經(jīng)驗確定細胞加載所需指示劑的確切濃度。
3）.如果您的細胞中含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則可將丙磺舒（1-2.5 mM）或亞砜并吡嗪（0.1-0.25 mM）添加到細胞培養(yǎng)基中，以減少去酯化指示劑的泄漏。在室溫或37°C下將細胞與AM酯孵育20分鐘至一小時。
注意：降低裝載溫度可能會減少指示器的分隔。
4）.在無細胞活力指示劑的緩沖液（如果適用，包含陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑）中洗滌細胞，以去除多余的探針。
注意：立即通過流式細胞儀分析細胞樣品，以測定零時每個細胞的平均熒光強度，無需清洗。
5）.在所需的Ex / Em波長下運行實驗。
2、鈣黃綠素紅鈉鹽參數(shù)
E x (nm) 562
E m (nm) 576
分 子 量 825.44
溶 劑 Water
存儲條件 在零下15度以下保存，避免光照
3、鈣黃綠素紅鈉鹽簡介
鈣黃綠素AM是流行的熒光探針之一，用于標記和檢測活細胞的細胞功能。但是，鈣黃綠素AM的單色使得無法在多色應用中使用這種有價值的試劑。例如，由于與GFP相同的顏色，不可能在結(jié)合GFP的細胞中使用鈣黃綠素AM。為了解決鈣黃綠素AM的顏色限制，我們開發(fā)了鈣黃綠橙 ，鈣黃綠 和鈣黃綠 。這些新的Calcein AM類似物與Calcein AM結(jié)合使用，可以對活細胞進行多色標記和功能分析。非熒光鈣黃綠素 AM可以輕松進入活細胞并水解產(chǎn)生強熒光鈣黃綠素 染料。可以使用通用的TRITC / Cy3濾波片組檢測Calcein Red 染料。
4.參考文獻
Functional imaging of neuronal activity of auditory cortex by using Cal-520 in anesthetized and awake mice
Authors: Jingcheng Li, Jianxiong Zhang, Meng Wang, Junxia Pan, Xiaowei Chen, Xiang Liao
Journal: Biomedical Optics Express (2017): 2599--2610
NINJ2--A novel regulator of endothelial inflammation and activation
Authors: Jingjing Wang, Jingjing Fa, Pengyun Wang, Xinzhen Jia, Huixin Peng, Jing Chen, Yifan Wang, Chenhui Wang, Qiuyun Chen, Xin Tu
Journal: Cellular Signalling (2017)
Erythropoietin Stimulates Endothelial Progenitor Cells to Induce Endothelialization in an Aneurysm Neck After Coil Embolization by Modulating Vascular Endothelial Growth Factor
Authors: Peixi Liu, Yingjie Zhou, Qingzhu An, Yaying Song, Xi Chen, Guo-Yuan Yang, Wei Zhu
Journal: MEDICINE (2016): 1--8
Flexible Endoscopic Spray Application of Respiratory Epithelial Cells as Platform Technology to Apply Cells in Tubular Organs
Authors: Anja Lena Thiebes, Manuel Armin Reddemann, Johannes Palmer, Reinhold Kneer, Stefan Jockenhoevel, Christian Gabriel Cornelissen
Journal: Tissue Engineering Part C: Methods (2016): 322--331
Influence of hypothermia and subsequent rewarming upon leukocyte-endothelial interactions and expression of Junctional-Adhesion-Molecules A and B
Authors: Nicolai V Bogert, Isabella Werner, Angela Kornberger, Patrick Meybohm, Anton Moritz, Till Keller, Ulrich A Stock, Andres Beiras-Fernandez
Journal: Scientific reports (2016)
Inhibition of ABC transport proteins by oil sands process affected water
Authors: Hattan A Alharbi, David MV Saunders, Ahmed Al-Mousa, Jane Alcorn, Alberto S Pereira, Jonathan W Martin, John P Giesy, Steve B Wiseman
Journal: Aquatic Toxicology (2016): 81--88
Rapid generation of collagen-based microtissues to study cell--matrix interactions
Authors: Marie-Elena Brett, Alexandra L Crampton, David K Wood
Journal: Technology (2016): 1--8
Toxicokinetics and toxicodynamics of chlorpyrifos is altered in embryos of Japanese medaka exposed to oil sands process-affected water: evidence for inhibition of P-glycoprotein
Authors: Hattan A Alharbi, Jane Alcorn, Ahmed Al-Mousa, John P Giesy, Steve B Wiseman
Journal: Journal of Applied Toxicology (2016)
Spraying respiratory epithelial cells to coat tissue-engineered constructs
Authors: Anja Lena Thiebes, Stefanie Albers, Christian Klopsch, Stefan Jockenhoevel, Christian G Cornelissen
Journal: BioResearch open access (2015): 278--287
The efficient hemostatic effect of Antarctic krill chitosan is related to its hydration property
Authors: Shuai Wu, Zhuoyao Huang, Jianhui Yue, Di Liu, Ting Wang, Pierre Ezanno, Changshun Ruan, Xiaoli Zhao, William W Lu, Haobo Pan
Journal: Carbohydrate polymers (2015): 295--303
AM酯是非極性酯，很容易穿過活細胞膜，并被活細胞內(nèi)的細胞酯酶迅速水解。AM酯被廣泛用于無創(chuàng)地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須特別注意，因為它們易于水解，特別是在溶液中。在使用高質(zhì)量無水二甲基亞砜（DMSO）之前，應將其重新配制。DMSO儲備溶液可在-20°C的環(huán)境中干燥保存，并避光。在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。該協(xié)議僅提供指南，應根據(jù)您的特定需求進行修改。
1）.準備2至5 mM的AM酯高品質(zhì)無水DMSO儲備溶液。非離子型洗滌劑F-127有時用于增加AM酯的水溶性。
注：20％的Pluronic等體積® F-127溶液可以稀釋到裝載緩沖器之前加入到細胞活力指標DMSO儲備溶液。終的Pluronic ® F-127的濃度為約0.02％。
2）.在實驗當天，將細胞活力的固體指示劑溶解在DMSO中，或?qū)⒅甘緞﹥淙芤旱牡确衷嚇咏鈨鲋潦覝亍Ｔ谀x擇的緩沖液（例如Hanks和Hepes緩沖液）中準備1至10 µM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，建議終濃度為4至5 µM的細胞活力指標。必須根據(jù)經(jīng)驗確定細胞加載所需指示劑的確切濃度。
3）.如果您的細胞中含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則可將丙磺舒（1-2.5 mM）或亞砜并吡嗪（0.1-0.25 mM）添加到細胞培養(yǎng)基中，以減少去酯化指示劑的泄漏。在室溫或37°C下將細胞與AM酯孵育20分鐘至一小時。
注意：降低裝載溫度可能會減少指示器的分隔。
4）.在無細胞活力指示劑的緩沖液（如果適用，包含陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑）中洗滌細胞，以去除多余的探針。
注意：立即通過流式細胞儀分析細胞樣品，以測定零時每個細胞的平均熒光強度，無需清洗。
5）.在所需的Ex / Em波長下運行實驗。
2、鈣黃綠素紅鈉鹽參數(shù)
E x (nm) 562
E m (nm) 576
分 子 量 825.44
溶 劑 Water
存儲條件 在零下15度以下保存，避免光照
3、鈣黃綠素紅鈉鹽簡介
鈣黃綠素AM是流行的熒光探針之一，用于標記和檢測活細胞的細胞功能。但是，鈣黃綠素AM的單色使得無法在多色應用中使用這種有價值的試劑。例如，由于與GFP相同的顏色，不可能在結(jié)合GFP的細胞中使用鈣黃綠素AM。為了解決鈣黃綠素AM的顏色限制，我們開發(fā)了鈣黃綠橙 ，鈣黃綠 和鈣黃綠 。這些新的Calcein AM類似物與Calcein AM結(jié)合使用，可以對活細胞進行多色標記和功能分析。非熒光鈣黃綠素 AM可以輕松進入活細胞并水解產(chǎn)生強熒光鈣黃綠素 染料。可以使用通用的TRITC / Cy3濾波片組檢測Calcein Red 染料。
4.參考文獻
Functional imaging of neuronal activity of auditory cortex by using Cal-520 in anesthetized and awake mice
Authors: Jingcheng Li, Jianxiong Zhang, Meng Wang, Junxia Pan, Xiaowei Chen, Xiang Liao
Journal: Biomedical Optics Express (2017): 2599--2610
NINJ2--A novel regulator of endothelial inflammation and activation
Authors: Jingjing Wang, Jingjing Fa, Pengyun Wang, Xinzhen Jia, Huixin Peng, Jing Chen, Yifan Wang, Chenhui Wang, Qiuyun Chen, Xin Tu
Journal: Cellular Signalling (2017)
Erythropoietin Stimulates Endothelial Progenitor Cells to Induce Endothelialization in an Aneurysm Neck After Coil Embolization by Modulating Vascular Endothelial Growth Factor
Authors: Peixi Liu, Yingjie Zhou, Qingzhu An, Yaying Song, Xi Chen, Guo-Yuan Yang, Wei Zhu
Journal: MEDICINE (2016): 1--8
Flexible Endoscopic Spray Application of Respiratory Epithelial Cells as Platform Technology to Apply Cells in Tubular Organs
Authors: Anja Lena Thiebes, Manuel Armin Reddemann, Johannes Palmer, Reinhold Kneer, Stefan Jockenhoevel, Christian Gabriel Cornelissen
Journal: Tissue Engineering Part C: Methods (2016): 322--331
Influence of hypothermia and subsequent rewarming upon leukocyte-endothelial interactions and expression of Junctional-Adhesion-Molecules A and B
Authors: Nicolai V Bogert, Isabella Werner, Angela Kornberger, Patrick Meybohm, Anton Moritz, Till Keller, Ulrich A Stock, Andres Beiras-Fernandez
Journal: Scientific reports (2016)
Inhibition of ABC transport proteins by oil sands process affected water
Authors: Hattan A Alharbi, David MV Saunders, Ahmed Al-Mousa, Jane Alcorn, Alberto S Pereira, Jonathan W Martin, John P Giesy, Steve B Wiseman
Journal: Aquatic Toxicology (2016): 81--88
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Authors: Marie-Elena Brett, Alexandra L Crampton, David K Wood
Journal: Technology (2016): 1--8
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Authors: Hattan A Alharbi, Jane Alcorn, Ahmed Al-Mousa, John P Giesy, Steve B Wiseman
Journal: Journal of Applied Toxicology (2016)
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Authors: Anja Lena Thiebes, Stefanie Albers, Christian Klopsch, Stefan Jockenhoevel, Christian G Cornelissen
Journal: BioResearch open access (2015): 278--287
The efficient hemostatic effect of Antarctic krill chitosan is related to its hydration property
Authors: Shuai Wu, Zhuoyao Huang, Jianhui Yue, Di Liu, Ting Wang, Pierre Ezanno, Changshun Ruan, Xiaoli Zhao, William W Lu, Haobo Pan
Journal: Carbohydrate polymers (2015): 295--303
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