一、細(xì)胞表面染色操作流程

①細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù)；500g離心4min，去上清。

②制備單細(xì)胞懸液

將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個(gè)細(xì)胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液。

③（可選）阻斷Fc受體

室溫孵育10-20min。

④一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應(yīng)30min。

⑤洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑥二抗孵育

對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min。對(duì)于直標(biāo)抗體直接跳到步驟8。

⑦ 洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑧重懸細(xì)胞

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。
 

二、細(xì)胞胞內(nèi)染色操作流程

①細(xì)胞計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù)；500g離心4min，去上清。

②制備單細(xì)胞懸液

將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個(gè)細(xì)胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液，400g離心5min去上清。

③固定

每孔加入100μl細(xì)胞固定劑重懸細(xì)胞，2-8°孵育20min。

④洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑤洗滌

每孔加入100μl細(xì)胞通透劑重懸細(xì)胞，室溫孵育20min。

⑥洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑦ (可選）阻斷Fc受體：

10-20min。

⑧一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應(yīng)30min。

⑨洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑩二抗孵育

對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min。對(duì)于直標(biāo)抗體直接跳到步驟11。

⑪洗滌

400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍。

⑫上機(jī)分析

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。
 

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