一、儀器介紹
轉(zhuǎn)棒儀本質(zhì)上是一種簡單的設(shè)備，設(shè)計來轉(zhuǎn)動水平旋轉(zhuǎn)桿。該測試的商業(yè)化導(dǎo)致了一種更復(fù)雜的設(shè)備的逐步演變。該設(shè)備以電子方式運行，并且可以很容易地編程，以提供更為定制的數(shù)據(jù)收集方法，甚至可以提供安全、質(zhì)量可靠、符合GLP的數(shù)據(jù)記錄，以滿足藥物開發(fā)中的法規(guī)遵從性。使用該設(shè)備的較新版本，旋轉(zhuǎn)桿可以在預(yù)先編程的時間段內(nèi)以任意數(shù)量的不同速度運行，從而可以在同一試驗中完成分步測試。同樣地，該裝置可以被編程為在不同的時間長度內(nèi)以不同的加速度加速，并且甚至可以在需要時反向運行橫桿。因此，有許多選項來修改測試方案，以適應(yīng)實驗的具體要求。然而，就大多數(shù)實驗?zāi)康亩�言，定速和加速版本被廣泛使用，可以認(rèn)為是廣泛的實驗?zāi)Ｐ皖I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，可以滿足大多數(shù)實驗室的需求。

儀器主要包括一個旋轉(zhuǎn)桿，驅(qū)動電機和齒輪傳動系統(tǒng)。旋轉(zhuǎn)桿的長度和直徑取決于要測試的嚙齒動物種類。以小鼠為例，轉(zhuǎn)棒儀器的尺寸：旋轉(zhuǎn)桿直徑約為3cm，商業(yè)設(shè)備中的桿通常由有機玻璃或其他硬質(zhì)塑料制成，旋轉(zhuǎn)桿表面沿縱軸形成一系列平行的水平凹槽，使小鼠能夠有效地抓住它。凹槽的深度是一個至關(guān)重要的細節(jié)，如果小鼠不能實現(xiàn)良好的抓握力，測試將會非常困難；另一方面，如果抓握力太好了，小鼠會被動地抓住桿跟隨其旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)桿通常支撐在儀器底座上方30～50cm，如果設(shè)置的高度太低，容易導(dǎo)致動物不進行任務(wù)，而傾向于從桿上跳下來。在儀器的底部放置一個柔軟的軟墊，給跌落下來的小鼠作為緩沖。正常情況下，這種儀器墜落并不會對動物造成任何傷害。可以根據(jù)需要設(shè)計測試容量，商業(yè)設(shè)備通常包括多個通道（一般設(shè)置6個通道），可以并行測試相應(yīng)數(shù)量的動物。有些商業(yè)設(shè)備設(shè)計為每個通道可以獨立開始實驗。通道由塑料隔板或者法蘭（圓形的部件）隔開，法蘭的直徑為20～30cm。通道的寬度約為6cm，但如果未成年小鼠傾向于在桿上轉(zhuǎn)身，可能需要調(diào)整得更小。一般商業(yè)設(shè)備的轉(zhuǎn)速范圍為0-100rpm/min（一般實驗設(shè)計速度范圍為4～40rpm），精度為0.1rpm/min。實驗時間可分段，每段可以設(shè)置不同的時間、速度、加速度，可靈活設(shè)置勻加速、勻減速實驗。

設(shè)備包括定時裝置，它在電機打開時會自動啟動，每個通道下鋪設(shè)有紅外旋轉(zhuǎn)桿，旋轉(zhuǎn)桿中斷時，代表動物跌落，計時停止，用于測量從旋轉(zhuǎn)桿上跌落的潛伏期。潛伏期數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C上，并記錄動物落棒的原因（例如跌落、跳躍）。儀器也可以自動統(tǒng)計每組的均值、標(biāo)準(zhǔn)差，方便查看結(jié)果。大鼠的關(guān)鍵設(shè)備參數(shù)可設(shè)置為：旋轉(zhuǎn)桿直徑7～8cm，距離地面50cm，通道寬10cm。


二、實驗動物的選擇

轉(zhuǎn)棒疲勞儀適用于嚙齒類動物，更通常用于評估小鼠的運動能力。越來越多的研究人員正在使用轉(zhuǎn)基因（Tg）小鼠疾病模型作為探測疾病過程的生化，細胞和行為方面的工具，并篩選新的治療方法。因此，對Tg模型的背景品系的選擇對于對這些動物的疾病狀態(tài)進行準(zhǔn)確的多因素評估至關(guān)重要。為了確定運動測試中表現(xiàn)的品系差異，以評估它們在預(yù)期運動參數(shù)發(fā)生變化的疾病中作為基因修飾小鼠的背景品系的適用性，并確定小鼠表現(xiàn)是否隨時間以品系特異性方式變化（這可能成為長期重復(fù)測試研究的混雜變量），有研究使用了六種近交小鼠品系進行測試，使用的品系包括129S2/SvHsd，BALB/cOlaHsd，C3H/HeHNsd，C57BL/6J，CBA/CaOlaHsd，DBA/2OlaHsd。結(jié)果表明，在旨在量化小鼠運動協(xié)調(diào)性的行為任務(wù)中存在相當(dāng)大的品系差異，而且，品系特定的表現(xiàn)變化可以隨著重復(fù)測試而變化。DBA/2在定速旋轉(zhuǎn)任務(wù)上的表現(xiàn)明顯差于使用的其他小鼠品系的表現(xiàn)，并且有點令人驚訝的是，表現(xiàn)的損害發(fā)生在相對較低的速度（7～23rpm）下，而不是在更高的速度下。

有趣的是，CBA/Ca的表現(xiàn)隨時間變化最明顯，在第8周表現(xiàn)似乎比其他幾周更具彈性。定速旋轉(zhuǎn)任務(wù)比更常用的加速旋轉(zhuǎn)任務(wù)對小鼠的運動變化更敏感，后者未能確定品系或重復(fù)試驗的顯著主要影響。另外，與以往研究一致，C57BL/6J和CBA/Ca小鼠品系在加速旋轉(zhuǎn)任務(wù)上表現(xiàn)良好，而DBA小鼠表現(xiàn)不佳，這表明加速旋轉(zhuǎn)是評估運動協(xié)調(diào)的可靠方法。特別令人感興趣的是發(fā)現(xiàn)，隨著重復(fù)測試，表現(xiàn)存在品系特定的變化。使用的6種小鼠品系中有5種的表現(xiàn)隨著時間的推移保持穩(wěn)定。然而，DBA/2小鼠了解到從桿上掉下來會產(chǎn)生有益的后果（返回飼養(yǎng)籠），因此沒有動力留在設(shè)備上。這種行為適應(yīng)導(dǎo)致了這種特定小鼠品系的較大誤差，并導(dǎo)致整體的顯著影響。我們建議，如果要將Tg小鼠用于行為測試，則必須非常小心地選擇維持Tg小鼠系的潛在背景品系。129S2/Sv品系和DBA/2品系作為純品系不適合進行行為測試，這是因為前者品系的冷漠性質(zhì)和后者的性能可變性。

也有研究者研究了一些近交系，以確定轉(zhuǎn)棒測試的任務(wù)表現(xiàn)和運動學(xué)習(xí)是否存在遺傳變異。在改進的加速版本的轉(zhuǎn)棒模型中，小鼠每天接受三次試驗，持續(xù)三天，并記錄每天的轉(zhuǎn)棒表現(xiàn)。測試了雄性和雌性129S1/SvlmJ、A/J、BALB/cByJ、C3H/HeJ、C57BL/6J、CBA/J、DBA/2J和FVB/NJ小鼠。在運動表現(xiàn)方面觀察到了品系和性別差異。一些品系通常表現(xiàn)更好（如C57BL/6J和CBA/J），而其他品系表現(xiàn)較差（如A/J）。129S1/SvImJ與其他亞系相比為中等表現(xiàn)，其中129S6/SvEvTac表現(xiàn)最好，129P1/ReJ表現(xiàn)最差。不同品系的運動學(xué)習(xí)能力也有所不同，因為一些品系在三天內(nèi)表現(xiàn)出任務(wù)表現(xiàn)提高，而其他品系則沒有，如DBA/2J、A/J在連續(xù)訓(xùn)練中沒有表現(xiàn)出運動技能的學(xué)習(xí)能力。

這些研究綜合表明，背景品系的選擇是轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型中運動缺陷重復(fù)行為評估的關(guān)鍵考慮因素。

三、實驗程序
轉(zhuǎn)棒測試通過評估動物保持在旋轉(zhuǎn)桿上的能力，比較對照組與疾病模型/干預(yù)組嚙齒動物的運動表現(xiàn)。轉(zhuǎn)棒任務(wù)可以使用多個版本的方案，主要是轉(zhuǎn)速、加速度和測試時間等參數(shù)有所不同。

1.實驗材料：

1)適當(dāng)?shù)男∈笃废岛惋曫B(yǎng)環(huán)境。

2)70%乙醇噴霧和吸水性紙巾用于清潔儀器。

3)轉(zhuǎn)棒疲勞儀。

2.設(shè)備運行準(zhǔn)備：

1)設(shè)置旋轉(zhuǎn)桿的速度，在現(xiàn)代商業(yè)儀器上，這是一個可編程的參數(shù)。

2)檢測紅外光束是否靈敏度正常。

3.訓(xùn)練動物：

動物應(yīng)適應(yīng)實驗設(shè)備，以盡量減少可能導(dǎo)致它們無意中從桿上掉下來的焦慮和探索行為。

1)對于運動協(xié)調(diào)能力的測試，不需要采集訓(xùn)練時的數(shù)據(jù)。

2)先設(shè)置一個較慢的轉(zhuǎn)棒速度，通常為4rpm，將小鼠放置在旋轉(zhuǎn)桿上，這樣運行1min。對于正常小鼠，將桿的速度提高到10rpm，運行2min，當(dāng)在這個速度下成功時，進一步增加速度到30rpm，并讓小鼠再保持3min。在這一階段完成后，根據(jù)使用的小鼠品系，應(yīng)該給予小鼠15分鐘的休息或允許繼續(xù)訓(xùn)練。附帶條件是，如果訓(xùn)練過程中它們從桿上掉下來，應(yīng)該將其放回到它們的飼養(yǎng)籠里進行15分鐘的恢復(fù)。

3)完成上述訓(xùn)練后，允許小鼠繼續(xù)訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)棒測試的試驗。將它們放置在儀器上，并允許它們按照測試程序進行試驗（見下文），直到它們達到穩(wěn)定的表現(xiàn)水平。

4)對于加速版本轉(zhuǎn)棒實驗，小鼠放置在旋轉(zhuǎn)桿上，桿加速到預(yù)設(shè)的終點，通常初始速度為4rpm，加速度為20rpm/min，直到達到最大速度40rpm。對于固定速度的方案，應(yīng)該訓(xùn)練小鼠在每個速度下達到最佳表現(xiàn)。

5)在訓(xùn)練結(jié)束后，至少等待24小時再進行正式試驗。

4.用轉(zhuǎn)棒儀測量動物的運動協(xié)調(diào)/平衡

對于所有試驗，在試驗前30min將小鼠帶到實驗室，以確保它們完全清醒。一般來說，為了讓肌肉力量和覺醒水平恢復(fù)到正常，在每次運動測試后都放回到籠子里，讓小鼠休息。

4.1加速旋轉(zhuǎn)版本測試

1)捏住小鼠尾巴后1/3處，將小鼠放在靜止的旋轉(zhuǎn)桿上，背向桿旋轉(zhuǎn)的方向，每個通道里都放一只小鼠。

2)啟動轉(zhuǎn)棒，并同時開始自動計時。一般加速度設(shè)置為20rpm/min。

3)當(dāng)小鼠從旋轉(zhuǎn)桿上掉下來時，如果可能的話，及時將它從設(shè)備里取出，然后放回籠子里。

4)在5min結(jié)束時，將所有仍然保持在桿上的小鼠移到飼養(yǎng)籠里。

5)記錄小鼠從旋轉(zhuǎn)桿上跌落下來的潛伏期（小鼠停留在旋轉(zhuǎn)桿上的時間），如果它們成功完成了整個測試周期，則記錄最大分?jǐn)?shù)300秒。

6)通常，理想的方法是進行多次試驗，重復(fù)試驗兩到三次，每次至少間隔15min。

7)計算出這些試驗得分的平均值。這是一種典型的方法，但如果對每個單獨試驗的表現(xiàn)都很感興趣，也可以使用原始形式的數(shù)據(jù)。

8)采用非配對t檢驗分析兩組動物在單個試驗數(shù)據(jù)或平均試驗的單個數(shù)據(jù)集的差異。

9)如果對一系列試驗的表現(xiàn)感興趣，則需要進行多因素方差分析（ANOVA），包括一個受試者內(nèi)因素（試驗次數(shù)、藥物劑量或重復(fù)測量設(shè)計中的其他測試條件）和任何受試者間因素（例如，腦區(qū)損毀、基因型或小鼠之間不同的治療）。對于縱向研究，將增加一個額外的受試者內(nèi)因素（時間點或年齡）。

4.2定速旋轉(zhuǎn)版本測試

1)將旋轉(zhuǎn)桿的速度設(shè)置在所需的最低速度。

2)將小鼠放在旋轉(zhuǎn)桿上，每個通道里都放上一只小鼠。

3)啟動轉(zhuǎn)棒，并同時開始自動計時，測試時間最長1min。

4)當(dāng)小鼠從旋轉(zhuǎn)桿上掉下來時，如果可能的話，及時將它從設(shè)備里取出，然后放回籠子里。

5)當(dāng)所有小鼠完成1min的試驗后，移出它們，然后放回到飼養(yǎng)籠里。

6)記錄下小鼠能夠保持在旋轉(zhuǎn)桿上的潛伏期時間。

7)每個試驗之間至少間隔5min。

8)將設(shè)備重置到下一個要使用的速度。

9)重復(fù)步驟2）至8），直到對所有所需的旋轉(zhuǎn)桿速度進行完試驗為止。

10)通常需要進行多次試驗。在最小間隔15min后，以新的上升速度系列重復(fù)測試。

11)計算這些試驗得分的平均值。這是一種典型的方法，但如果每個試驗的表現(xiàn)都感興趣，請使用原始形式的數(shù)據(jù)。

12)如果只使用單個速度來確定兩組小鼠之間的差異，則應(yīng)用非配對t檢驗。對于多個速度，應(yīng)用至少一個受試者內(nèi)部因素（桿速度）和通常至少一個受試者間因素（例如，基因型或損毀組）的方差分析。

13)藥物或其他治療將在分析中提供第三個處理因素，受試者內(nèi)因素或受試者間因素取決于采用的是重復(fù)測量還是隨機設(shè)計。對于縱向研究，還需要第二個受試者內(nèi)變量（時間點）。

四、數(shù)據(jù)收集和評價指標(biāo)
大多數(shù)方案要么測試動物在給定的時間內(nèi)停留的最大速度，要么測試動物在不同速度下跌落所需的時間。商業(yè)轉(zhuǎn)棒儀可以自動記錄動物的跌落潛伏期（動物保持在桿上的時間）和跌落時的旋轉(zhuǎn)速度，這是動物運動協(xié)調(diào)性的主要指標(biāo)，尤其是前者。同時還能記錄試驗結(jié)束的原因，跌落、跳躍或被動旋轉(zhuǎn)。一些研究也應(yīng)用了額外的或替代的指標(biāo)，例如運動的距離，在規(guī)定的持續(xù)時間內(nèi)在旋轉(zhuǎn)桿上保持平衡的動物數(shù)量，或在實驗運行期間從旋轉(zhuǎn)桿上跌落和動物抓住桿被動旋轉(zhuǎn)的次數(shù)。另外，可以以日期為橫坐標(biāo)，潛伏期為縱坐標(biāo)繪制初始實驗期間的任務(wù)學(xué)習(xí)曲線，通常隨著每日訓(xùn)練任務(wù)表現(xiàn)顯著提高。

五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
根據(jù)研究人員的經(jīng)驗，在轉(zhuǎn)棒測試中，大約8只動物的樣本量就能提供足夠的能力來檢測組平均值中10%到15%的差異。對于方差的統(tǒng)計同質(zhì)性，小鼠的數(shù)量至少不應(yīng)低于6只。

根據(jù)需要對數(shù)據(jù)進行方差分析，在適當(dāng)?shù)那闆r下，使用組間重復(fù)測量比較。對于事后分析，TukeyHSD測試用于確定組之間的成對差異，Dunnetts測試用于確定給定數(shù)據(jù)集與該數(shù)據(jù)集的控制值之間的顯著差異。當(dāng)存在顯著的相互作用時，使用Sidak檢驗在組間進行一系列獨立的事后兩兩比較。差異在P＜0.05時被認(rèn)為是顯著的。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

六、注意事項
1.小鼠五到八只為一籠，飼養(yǎng)在溫度，濕度和光受控的環(huán)境中。保持12小時光/暗循環(huán)，早上8點亮燈。飼養(yǎng)室和實驗室的溫度保持在20±2°C,相對濕度為60%。除非在實驗過程中，平時小鼠可以隨意獲得食物和水。盡一切努力盡量減少動物的數(shù)量及其痛苦。

2.在行為測試之前，撫摩大鼠和小鼠是很重要的（所有組中的所有動物都以相同的方式撫摩到相同的程度）。這將使動物克服會對表現(xiàn)產(chǎn)生重大影響的自然恐懼和焦慮反應(yīng)。

3.在測試開始之前，將動物送至行為測試室，讓它們不受干擾地適應(yīng)30分鐘，然后稱重并記錄。測試可以在上午8點至下午4點之間進行，重要是是保持不同測試日的測試時間點一致。

4.不同小鼠品系獲得穩(wěn)定的基線表現(xiàn)水平所需的訓(xùn)練量有所不同，但長時間暴露于逐漸增加的旋轉(zhuǎn)速度的一般原則是適用的。在訓(xùn)練過程中，如果該方案對所使用的特定小鼠品系來說太累，可能有必要允許小鼠休息，休息15分鐘通常是足夠的。

5.所需的試驗次數(shù)可能因使用的小鼠品系而有所不同。在腦區(qū)損毀或遺傳性疾病模型的小鼠中，建議進行一次以上的試驗，因為單個實驗動物的分?jǐn)?shù)通常有更大的差異。類似地，在縱向研究中，如果小鼠有一段時間沒有進行過測試了，第一次試驗可以作為提醒，在這種情況下，可能需要3次或4次試驗，可采用后2次或3次數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析。

6.實驗時轉(zhuǎn)棒速度的設(shè)計應(yīng)考慮到疾病的嚴(yán)重程度。應(yīng)該至少有一個較慢的速度，使大多數(shù)小鼠能夠保持在旋轉(zhuǎn)桿上。理想情況下，后續(xù)的速度應(yīng)該產(chǎn)生一個代表疾病或其他處理因素（如給藥測試）嚴(yán)重程度的數(shù)據(jù)曲線。無法進行任務(wù)的比例應(yīng)低于10%。隨著動物在疾病的后期變得更加虛弱，這種情況可能會增加。

7.最好在開始研究之前選擇重新測試的頻率。例如，如果正在研究一種測試化合物的短期影響，那么一次測試可能就足夠了。然而，如果正在調(diào)查復(fù)合治療、損毀或其他治療的長期影響，或者如果確定慢性表型，最好在幾周內(nèi)每周進行重新測試，或連續(xù)幾個月每月進行重新測試。因此，在開始主要研究之前，通常需要進行預(yù)實驗來確定適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)計、測試頻率、發(fā)病年齡和表型持續(xù)時間。

8.一定要在每只被測試小鼠之間對設(shè)備進行清潔和消毒。小鼠經(jīng)常在旋轉(zhuǎn)桿上小便和排便。桿子上的尿液和糞便會損害其他測試小鼠的表現(xiàn)。因此，經(jīng)常清洗儀器是很重要的。

9.實驗室環(huán)境在測試期間應(yīng)保持溫度、濕度和光強度不變。