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qPCR實驗中引物設計的詳細步驟介紹

瀏覽次數:3473 發布日期:2022-8-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

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何成為qPCR高手?
今天要講的是引物篇。


“擎科小講堂”上周推出了qPCR高手養成記第一期干貨文章:耗材篇。大家呼聲很高,紛紛“催更”。本周我們將推出第二篇干貨內容:引物篇,圖文解析引物設計,助力實驗高效完成!

qPCR實驗中,引物設計是非常重要的一個環節,引物的合適與否與擴增效率是否達標、擴增產物是否特異、實驗結果是否可用等息息相關。

您是不是在qPCR引物設計中感到困惑:如何使引物特異性佳?有沒有什么一勞永逸的方法?
在設計qPCR引物時,通常要留意以下幾點:
  • 引物盡量要跨內含子設計

  • 產物長度100-300 bp

  • TM值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近

  • 引物末端是G或C
     

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這么多的點要留意怎么辦?今天擎小科帶您一起五步搞定qPCR引物設計,讓qPCR引物設計成為你的絕殺技能。
 

第一步:查詢基因

通過NCBI查詢Homo GAS6的基因,這里要注意對比基因名稱、種屬,確保都要一致。

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第二步:找到基因序列
1.若目標序列為基因組DNA,則選擇第一個,為該基因的基因組DNA序列。若目標序列為mRNA,則選擇第二個
 

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2.進入后,點擊如下表的“CDS”,棕色背景序列即為該基因的編碼序列。
 

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第三步:設計引物
1.進入Primer-BLAST界面。
 

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2.在左上方輸入基因序列號或Fasta格式的序列,填寫好相關參數。
 

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3.點擊“Get primers”NCBI就會彈出來告訴你,這樣的參數選擇會擴增到其他剪切變體,我們勾選不同的剪切變體并提交,就可以獲得合適的引物對了!(如下圖)
 

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這些引物對的退火溫度,都在60℃左右。根據實驗目的,選擇長度適中、特異性好和引物自身互補較少的引物進行實驗,成功率還是相當高的呢!
 

第四步:引物特異性驗證

Primer-Blast除了可以設計引物外,還可以對我們自己設計的引物進行評價。返回引物設計的頁面,輸入我們設計好的上下游引物,其它參數不調整,提交后就可以看到這對引物是否在其它基因上也存在啦,如果全部都顯示在我們想要擴增的基因中,說明這對引物的特異性棒棒噠!(舉例引物查詢結果只此一條噢!
 

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第五步:引物質量判斷
怎么樣的引物才是集擴增效率達標擴增產物特性好實驗結果可靠于一身呢,擎小科帶你領略一下。
 

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引物的擴增效率達到90%-110%即認為擴增效率較好,熔解曲線單峰且通常Tm>80℃即認為擴增特異性較好。相當簡單有木有啊~是不是感覺自己已經告別科研小白的身份,瞬間掌握了qPCR引物設計的絕招啦。
 

如果您在引物設計中遇到問題,來擎科!
如果您想直接獲取可靠的引物序列,來擎科!

擎科生物基于多年qPCR檢測服務經驗,對常見人源細胞信號通路相關基因進行了系統性的qPCR引物驗證,經多次篩選驗證,可提供擴增效果好、特異性高的引物庫套裝,助您的實驗事半功倍。訂購5對引物即可贈送500 µL 2×qPCR Mix

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發布者:北京擎科生物科技股份有限公司
聯系電話:400-668-3730
E-mail:zhangnan@tsingke.com.cn

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