一、稀釋標準曲線樣品
（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
■標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
■用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
■在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備
■如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
■用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒RNAout。

三、Probe qRT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）
■如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
■在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分	樣品管 N+2個	RT-PCR陰性對照	標準曲線樣品管 （1-6管）
2×Probe qRT-PCR MagicMix	各10 μL	10 μL	各10 μL
煙草花葉病毒RT-PCR 引物-探針混合液	各3 μL	3 μL	各3 μL
N+2個待測RNA樣本	各7 μL	不加	不加
超純水	不加	7 μL	不加
第6步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6號）	不加	不加	各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

■蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行RT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉(zhuǎn)錄	42℃	30 min
預(yù)變性	95℃	3 min
RT-PCR反應(yīng) （45個循環(huán)）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集FAM通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理
■如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
■如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。