三七（P. notoginseng）在中醫(yī)藥中被廣泛用于治療心血管疾病和血液系統(tǒng)疾病，也被許多國家視為重要的功能性食品，其根莖和根中所含的代謝物是三七發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而三七的組織結(jié)構(gòu)具有高度的異質(zhì)性，且三七代謝物的區(qū)域特異性分布也會(huì)導(dǎo)致三七不同植物部位的藥理作用不同，而目前研究三七代謝物空間分布的報(bào)道較少。

2021年4月，齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）團(tuán)隊(duì)在Journal of Ginseng Research  上發(fā)表了題為“Visualizing the distributions and spatiotemporal changes of metabolites in Panax notoginseng by MALDI mass spectrometry imaging”的文章。該文使用MALDI-MSI 方法對三七不同部位（包括根莖、主根、支根和須根）和不同微區(qū)（包括韌皮部、木質(zhì)部、髓質(zhì)和軟木）及三七蒸煮過程中代謝物的時(shí)空變化進(jìn)行成像分析，從而拓展了對植物代謝物空間特征的認(rèn)識，也為更細(xì)致地探索藥材加工過程中的分子變化提供了新途徑。

研究材料
三七根和根莖

技術(shù)路線
· 步驟1：優(yōu)化三七代謝物成像的MALDI基質(zhì)；
· 步驟2：三七不同組織及不同組織微區(qū)代謝產(chǎn)物的空間分布研究；
· 步驟3：三七蒸煮過程中代謝物的時(shí)空變化研究。

研究結(jié)果
1. 優(yōu)化三七代謝物成像的MALDI基質(zhì)
為了獲得更豐富的代謝物信息，作者對來自同一三七根上的三個(gè)相鄰切片分別噴涂 9-AA、CHCA 和 1,5-DAN基質(zhì)，然后比較了MALDI-MSI 在檢測三七根中代謝物的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng) 1,5-DAN 用作 MALDI 基質(zhì)時(shí)，所有檢測到的初級和次級代謝物都表現(xiàn)出更強(qiáng)的離子強(qiáng)度，例如三七皂苷-R1、人參皂苷-Re、蘋果酸 、棕櫚酸等（圖1）。
此外，作者在三七根切片中代謝物水平高的組織區(qū)域進(jìn)行了原位 MS/MS 實(shí)驗(yàn)。圖 2 顯示了典型的原位 MALDI-MS/MS 譜圖以及三七皂苷-R1 和人參皂苷-Re 的裂解途徑，結(jié)果表明皂苷傾向于碎裂糖苷鍵以產(chǎn)生特征產(chǎn)物離子。

圖1 比較9-AA、CHCA和1,5-DAN作為基質(zhì)在三七根切片中的代謝產(chǎn)物成像


圖2 三七皂苷-R1 (A) 和人參皂苷-Re (B) 的原位 MS/MS 譜圖

2. 三七不同組織及不同組織微區(qū)代謝產(chǎn)物的空間分布研究
將三七根切片進(jìn)一步分為韌皮部、木質(zhì)部、髓質(zhì)和軟木組織，然后使用優(yōu)化的 MALDI-MSI 方法對三七中不同類別代謝物的空間分布進(jìn)行了成像分析，包括三七皂苷、人參皂苷、氨基酸、丹參堿、葡萄糖酸和低分子量有機(jī)酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同代謝物在不同組織微區(qū)里的空間分布差異較大，例如三七皂苷-R1 在韌皮部和外木質(zhì)部顯示出更強(qiáng)的離子信號，而人參皂苷-Re在髓質(zhì)和內(nèi)木質(zhì)部中的含量遠(yuǎn)高于韌皮部和外木質(zhì)部，苯丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸主要分布在髓質(zhì)和韌皮部區(qū)域，包括蘋果酸和檸檬酸在內(nèi)的低分子量有機(jī)酸在韌皮部和髓質(zhì)中都表現(xiàn)出比木質(zhì)部更強(qiáng)的離子強(qiáng)度等（圖3）。
作者接著對同一株三七植物上的根莖、主根、分枝根和須根進(jìn)行了MALDI-MSI分析，并對根莖和不同根組織切片進(jìn)行了主成分分析 (PCA)，發(fā)現(xiàn)三七根莖的代謝物譜與三七根的代謝物譜有較大差異。質(zhì)譜成像顯示根莖和不同根組織中三七皂苷-R1的含量相似，三七皂苷-Fc 和人參皂苷-Re在根莖組織中表達(dá)較多，谷氨酰胺和天冬酰胺在根莖中呈現(xiàn)比根組織強(qiáng)得多的離子信號等(圖4)。

圖3 三七根切片不同微區(qū)中代表性代謝物的質(zhì)譜成像圖


圖4 三七不同組織切片的質(zhì)譜成像分析

3. 三七蒸煮過程中代謝物的時(shí)空變化研究
生三七和蒸三七都被認(rèn)為是治療各種疾病的重要藥物。三七在蒸制過程中代謝物的變化被認(rèn)為是造成生、熟三七藥理作用差異的重要原因。作者將三七根組織分成四等份，一份不蒸，另外三份分別在 110 ℃下蒸 20 min、1 h 和 2 h，然后組織切片并進(jìn)行MALDI-MS成像分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七皂苷-R1、三七皂苷-Fc和人參皂苷-Re等高豐度皂苷的含量在生三七根與蒸三七根中差異不大，可能不是生三七與蒸三七之間生物學(xué)差異的主要原因。另外結(jié)果還顯示一些代謝物隨蒸煮而發(fā)生變化，如蒸煮后三七根中的丹參堿含量顯著降低，精氨酸和谷氨酰胺的含量隨著蒸煮時(shí)間的延長而逐漸增加等，這些變化可能是生三七與蒸三七藥理作用不同的主要原因（圖5）。

圖5 生三七和三七蒸煮過程中代表性代謝物的質(zhì)譜成像分析

小結(jié)
本研究利用MALDI-MS成像技術(shù)，首次成功地成像了三七不同部位和不同微區(qū)的代謝物信息。此外，還研究了三七根蒸煮過程中代謝產(chǎn)物的時(shí)空變化，篩選出了一系列隨蒸煮過程而變化的代謝產(chǎn)物。

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