從CNS洞見單細胞蛋白質組學在免疫、干細胞分化、發育中的應用
單細胞蛋白質組是一項新興的技術，正處于蓬勃發展的時期。它可以揭示生命體內功能的真正執行者——蛋白質水平的變化，而引起了眾多科研人員的關注。但是也因為這項技術剛剛起步，大家對于如何應用，如何解決科學問題還抱有疑惑。因此，今天小編來跟大家分享一下單細胞蛋白質組學在免疫、干細胞分化、發育三個領域的應用，以期能給大家提供一些思路及靈感。
一、干細胞分化——單細胞組學揭示原發性急性髓系白血病干細胞分化過程
文獻名稱：Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchie
發表期刊：Nature Communications（IF 14.919）
樣本類型：原發性急性髓系白血病細胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細胞蛋白質組數據對細胞進行分群；
· 步驟2：比較不同細胞群之間的蛋白質差異，并發現分化的連續性；
· 步驟3：擬時序分析尋找驅動細胞分化的關鍵蛋白質。
主要內容：
1. 單細胞蛋白質組學可對不同分化階段的細胞進行分群
通過流式分選白血病干細胞分化的三個階段的細胞，進行單細胞蛋白質組分析。基于鑒定到的1790個蛋白質進行降維分析，可以清晰地分離三個已知的分化階段，再現了FACS分析的結果。
一、干細胞分化——單細胞組學揭示原發性急性髓系白血病干細胞分化過程
文獻名稱：Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchie
發表期刊：Nature Communications（IF 14.919）
樣本類型：原發性急性髓系白血病細胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細胞蛋白質組數據對細胞進行分群；
· 步驟2：比較不同細胞群之間的蛋白質差異，并發現分化的連續性；
· 步驟3：擬時序分析尋找驅動細胞分化的關鍵蛋白質。
主要內容：
1. 單細胞蛋白質組學可對不同分化階段的細胞進行分群
通過流式分選白血病干細胞分化的三個階段的細胞，進行單細胞蛋白質組分析。基于鑒定到的1790個蛋白質進行降維分析，可以清晰地分離三個已知的分化階段，再現了FACS分析的結果。
圖1-1 細胞分群結果
2. 同一類型細胞間蛋白質表達呈現差異性
將Blasts和其他細胞的蛋白質表達進行比較，從而鑒定到了Blasts和LSC與PROG的差異表達蛋白。有趣的是，這些差異蛋白在同一分化階段也呈現不一樣的表達，表明同一細胞類型的蛋白質表達是有差異的，即細胞分化是個連續性的過程，并且是由一些特定的蛋白質信號驅動的。這是在bulk組學中無法發現的。
圖1-3 擬時序分析
圖2-2 巨噬細胞極化呈連續性
圖2-3 單細胞轉錄組和單細胞蛋白質組聯合分析
三、發育——單細胞組學揭示小鼠性腺發育過程
文獻名稱：Dissecting Cell Lineage Specification and Sex Fate Determination in Gonadal Somatic Cells Using Single-Cell Transcriptomics
發表期刊：Cell Reports（IF 9.432）
研究背景：卵巢和睪丸具有相同的發育起源，在發育過程中出現兩性的區別，而對于在性別決定前性腺細胞譜系知之甚少。
樣本類型：Tg（Nr5a1-GFP）轉基因小鼠性腺
研究思路：
· 步驟1：對來自于六個階段的體細胞進行單細胞轉錄組分析并進行細胞分群；
· 步驟2：通過擬時序分析研究雌性體細胞發育過程；
· 步驟3：比較雌性和雄性的細胞分化過程，證明性別二態性。
主要內容：
1. 體細胞可分為四個細胞群體
從六個不同發育階段的轉基因小鼠性腺中，基于熒光蛋白的表達分選出體細胞進行單細胞轉錄組檢測，總共有563個細胞進行后續分析。根據這563個細胞mRNA的表達，分成了四個細胞簇，基于marker基因及每個簇基因表達的特異性對細胞簇進行定義，分別為早期和基質祖細胞，前顆粒細胞和出生后顆粒細胞。并通過GO分析對四個細胞群體的功能進行注釋。
圖3-1 早期卵巢發育過程中性腺體細胞的分類
2. 建立雌性體細胞發育譜系
接下來通過擴散圖模擬了細胞的分化趨勢，建立了細胞發育譜系。結果顯示顆粒細胞和基質細胞是從一個共同的祖細胞群分化而來。沿著擬時序對細胞進行排序，繪制隨時間的動態表達譜，根據表達模式將基因分類，并進行GO注釋，找到關鍵的驅動分化的基因。
圖3-2 早期卵巢發育過程中性腺體細胞的分化
3. 細胞分化呈現性別二態性
建立了雌性性腺的發育圖譜后，又將數據與過去的來自雄性性腺的400個體細胞的數據進行了整合，進行降維聚類，以及擬時序分析，證明了從D2細胞起細胞的分化開始出現性別差異，證明了性別二態性。這個文章就是通過單細胞組學進行降維及擬時序分析，研究細胞的分化過程。
圖3-3 兩種性別的細胞分化過程比較
研究思路總結
根據以上文獻可知，現在的單細胞蛋白質組學技術已經可以實現細胞的分群，細胞功能的注釋以及細胞的分化等研究，從蛋白質水平上去解決細胞的異質性的科學問題，推薦的研究思路如下：
圖1-2 差異蛋白的表達
3. 單細胞蛋白質組學可進行分化軌跡分析
基于單細胞蛋白質組學的數據進行擬時序分析，結果顯示細胞的分化軌跡與FACS數據一致，LSC位于頂點，分化產生了Blasts和PROG。但又發現CD38+和CD38-Blasts細胞沿著軌跡輕微分離，說明可能存在兩條平行的分化路徑。接下來繪制了沿著偽時間的蛋白質表達譜，揭示了驅動細胞排序的主要因素。
基于單細胞蛋白質組學的數據進行擬時序分析，結果顯示細胞的分化軌跡與FACS數據一致，LSC位于頂點，分化產生了Blasts和PROG。但又發現CD38+和CD38-Blasts細胞沿著軌跡輕微分離，說明可能存在兩條平行的分化路徑。接下來繪制了沿著偽時間的蛋白質表達譜，揭示了驅動細胞排序的主要因素。
圖1-3 擬時序分析
二、免疫——單細胞多組學聯合解析巨噬細胞異質性
文獻名稱：Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2
發表期刊：Genome Biology（13.583）
研究背景：巨噬細胞是具有不同功能和分子表型的先天免疫細胞，但這種多樣性在單細胞蛋白質水平上尚未進行深入研究。
樣本類型：PMA激活的單核細胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細胞蛋白質組數據對細胞進行分群；
· 步驟2：通過分析蛋白質的表達發現巨噬細胞存在異質性；
· 步驟3：聯合單細胞轉錄組和單細胞蛋白質組的數據比較RNA和蛋白質的共性及差異性。
主要內容：
1. 單細胞蛋白質組學可進行細胞分群
用PMA激活單核細胞的分化后，分選出1490個細胞進行單細胞蛋白質組學分析，總共鑒定到3042個蛋白質。通過PCA分析可將細胞分成兩個主要離散的細胞簇，根據細胞特異性表達的蛋白質可將兩個細胞簇分別對應于單核細胞和巨噬細胞。與bulk蛋白質組學相比，相關性為0.88，說明單細胞蛋白質組學數據的可靠性。
文獻名稱：Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2
發表期刊：Genome Biology（13.583）
研究背景：巨噬細胞是具有不同功能和分子表型的先天免疫細胞，但這種多樣性在單細胞蛋白質水平上尚未進行深入研究。
樣本類型：PMA激活的單核細胞
研究思路：
· 步驟1：基于單細胞蛋白質組數據對細胞進行分群；
· 步驟2：通過分析蛋白質的表達發現巨噬細胞存在異質性；
· 步驟3：聯合單細胞轉錄組和單細胞蛋白質組的數據比較RNA和蛋白質的共性及差異性。
主要內容：
1. 單細胞蛋白質組學可進行細胞分群
用PMA激活單核細胞的分化后，分選出1490個細胞進行單細胞蛋白質組學分析，總共鑒定到3042個蛋白質。通過PCA分析可將細胞分成兩個主要離散的細胞簇，根據細胞特異性表達的蛋白質可將兩個細胞簇分別對應于單核細胞和巨噬細胞。與bulk蛋白質組學相比，相關性為0.88，說明單細胞蛋白質組學數據的可靠性。
圖2-1 基于單細胞蛋白質組數據進行細胞分群
2. 巨噬細胞間呈現明顯的異質性
為了研究同質單核細胞是否會分化為同質巨噬細胞，根據細胞的Fiedler向量值對細胞進行無監督光譜分析，表征細胞異質性。單核細胞中高表達的蛋白質主要與增殖相關，包括染色質組織和翻譯；巨噬細胞中富含細胞表面信號傳導和細胞粘附相關蛋白，與細胞本身的生物功能一致。對巨噬細胞群體進行分析發現，巨噬細胞的蛋白質表達呈現連續性變化，先前鑒定為M1和M2極化的人原代巨噬細胞特異性表達蛋白質也在巨噬細胞之間差異表達。
為了研究同質單核細胞是否會分化為同質巨噬細胞，根據細胞的Fiedler向量值對細胞進行無監督光譜分析，表征細胞異質性。單核細胞中高表達的蛋白質主要與增殖相關，包括染色質組織和翻譯；巨噬細胞中富含細胞表面信號傳導和細胞粘附相關蛋白，與細胞本身的生物功能一致。對巨噬細胞群體進行分析發現，巨噬細胞的蛋白質表達呈現連續性變化，先前鑒定為M1和M2極化的人原代巨噬細胞特異性表達蛋白質也在巨噬細胞之間差異表達。
圖2-2 巨噬細胞極化呈連續性
3. 單細胞水平的轉錄組和蛋白質組呈現差異性
為了研究RNA和蛋白質水平的相似性和差異，利用來自相同生物學重復的細胞進行單細胞轉錄組分析，與單細胞蛋白質組進行比較分析。結果發現RNA和蛋白質的相關性呈現雙峰分布，即RNA和蛋白質兩個水平既具有共變基因（簇1），也具有呈相反的基因（簇2）。同時發現蛋白組的數據更加緊湊，轉錄組數據更加分散，表明RNA檢測中存在更大的生物學和技術變異性。
為了研究RNA和蛋白質水平的相似性和差異，利用來自相同生物學重復的細胞進行單細胞轉錄組分析，與單細胞蛋白質組進行比較分析。結果發現RNA和蛋白質的相關性呈現雙峰分布，即RNA和蛋白質兩個水平既具有共變基因（簇1），也具有呈相反的基因（簇2）。同時發現蛋白組的數據更加緊湊，轉錄組數據更加分散，表明RNA檢測中存在更大的生物學和技術變異性。
圖2-3 單細胞轉錄組和單細胞蛋白質組聯合分析
三、發育——單細胞組學揭示小鼠性腺發育過程
文獻名稱：Dissecting Cell Lineage Specification and Sex Fate Determination in Gonadal Somatic Cells Using Single-Cell Transcriptomics
發表期刊：Cell Reports（IF 9.432）
研究背景：卵巢和睪丸具有相同的發育起源，在發育過程中出現兩性的區別，而對于在性別決定前性腺細胞譜系知之甚少。
樣本類型：Tg（Nr5a1-GFP）轉基因小鼠性腺
研究思路：
· 步驟1：對來自于六個階段的體細胞進行單細胞轉錄組分析并進行細胞分群；
· 步驟2：通過擬時序分析研究雌性體細胞發育過程；
· 步驟3：比較雌性和雄性的細胞分化過程，證明性別二態性。
主要內容：
1. 體細胞可分為四個細胞群體
從六個不同發育階段的轉基因小鼠性腺中，基于熒光蛋白的表達分選出體細胞進行單細胞轉錄組檢測，總共有563個細胞進行后續分析。根據這563個細胞mRNA的表達，分成了四個細胞簇，基于marker基因及每個簇基因表達的特異性對細胞簇進行定義，分別為早期和基質祖細胞，前顆粒細胞和出生后顆粒細胞。并通過GO分析對四個細胞群體的功能進行注釋。
圖3-1 早期卵巢發育過程中性腺體細胞的分類
2. 建立雌性體細胞發育譜系
接下來通過擴散圖模擬了細胞的分化趨勢，建立了細胞發育譜系。結果顯示顆粒細胞和基質細胞是從一個共同的祖細胞群分化而來。沿著擬時序對細胞進行排序，繪制隨時間的動態表達譜，根據表達模式將基因分類，并進行GO注釋，找到關鍵的驅動分化的基因。
圖3-2 早期卵巢發育過程中性腺體細胞的分化
3. 細胞分化呈現性別二態性
建立了雌性性腺的發育圖譜后，又將數據與過去的來自雄性性腺的400個體細胞的數據進行了整合，進行降維聚類，以及擬時序分析，證明了從D2細胞起細胞的分化開始出現性別差異，證明了性別二態性。這個文章就是通過單細胞組學進行降維及擬時序分析，研究細胞的分化過程。
圖3-3 兩種性別的細胞分化過程比較
研究思路總結
根據以上文獻可知，現在的單細胞蛋白質組學技術已經可以實現細胞的分群，細胞功能的注釋以及細胞的分化等研究，從蛋白質水平上去解決細胞的異質性的科學問題，推薦的研究思路如下：
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