與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合活性分析成為小分子藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。小分子化合物藥物與靶點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)是非常重要的表征參數(shù)，直接影響到了化合物在體內(nèi)的半衰期以及所需的藥物劑量。但缺少高通量穩(wěn)定有效和耐用的生物物理/生化檢測(cè)方法成為阻礙小分子藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的障礙之一。
 
基于生物層干涉（BLI）技術(shù)的Octet檢測(cè)平臺(tái)具有高通量、高靈敏度（神藥二甲雙胍（129Da）的檢測(cè)）【1】、對(duì)DMSO等有機(jī)溶劑不敏感等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為小分子藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的中堅(jiān)力量，所以最近有幾篇文章用Octet做了海量的小分子數(shù)據(jù)，陳老濕這里show一下：
   
ITC技術(shù)對(duì)樣品本量需求大，并且對(duì)緩沖液、溫度和pH值敏感，因此限制了ITC技術(shù)在篩選復(fù)雜樣品庫(kù)中的應(yīng)用。SPR技術(shù)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物結(jié)合活性的分析，但是通量低，微流控的設(shè)計(jì)使其難以應(yīng)用于復(fù)雜樣品庫(kù)的篩選，芯片與化合物的非特異性問(wèn)題，小分子化合物的水溶性問(wèn)題，樣品和緩沖液折光率的差異導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題都限制了SPR技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，研究人員采用成本更低，通量更高，可耐受粗樣品的BLI技術(shù)檢測(cè)小分子化合物。
 
近期就有幾篇不錯(cuò)的應(yīng)用BLI技術(shù)開(kāi)發(fā)小分子藥物的文章發(fā)表，下面就讓陳老濕給大家作一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹（文末有陳老濕力推的小分子檢測(cè)“神功寶典”，記得看到最后哦！）。
  
 
➤ 用Octet建立DNA結(jié)合的小分子藥物篩選方法
    俄勒岡州立大學(xué)【2】
DNA已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的一個(gè)重要的藥理學(xué)作用靶點(diǎn)。由于DNA的靈活性以及缺少像蛋白質(zhì)那樣的結(jié)合位置，且小分子化合物結(jié)合后還可能導(dǎo)致DNA空間構(gòu)象改變，使得開(kāi)發(fā)新的化合物特異性結(jié)合靶標(biāo)DNA具有一定的挑戰(zhàn)性。 首先研究人員選取了6個(gè)已經(jīng)報(bào)道的與DNA結(jié)合的化合物優(yōu)化和調(diào)整檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果一致，證明了BLI技術(shù)可適合地、可靠地、有效地檢測(cè)從微生物中提取的復(fù)雜組分與DNA的結(jié)合。
   
隨后研究人員篩選了＞100個(gè)從微生物中提取的與DNA的結(jié)合的化合物，并且得到了幾個(gè)結(jié)合活性較高的化合物，包括棘霉素，放線菌素等。
  ➤ 新冠肺炎抗病毒藥物篩選與驗(yàn)證【3】
新冠病毒RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RdRp）是理想的抗病毒靶點(diǎn)。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員首先通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，篩選了15220個(gè)化合物。選擇結(jié)合最強(qiáng)的50個(gè)hits，通過(guò)Octet高通量的分析了這些化合物與靶點(diǎn)SARS-CoV-2 RdRp的結(jié)合活性。從中挑選結(jié)合活性強(qiáng)的化合物進(jìn)行體外和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)分析。研究人員發(fā)現(xiàn)Corilagin (RAI-S-37)作為SARS-CoV-2 RdRp的非核苷抑制劑，可直接與RdRp結(jié)合，在細(xì)胞外和細(xì)胞活性檢測(cè)中均能有效抑制聚合酶活性，抑制SARS-CoV-2感染的EC50值為0.13 μmol/L)。Corilagin具有良好的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)，使其成為新冠肺炎潛在的治療藥物。
   
 
➤ 人參活性組分作用靶點(diǎn)研究【4】
人參能夠調(diào)節(jié)大腦興奮性，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶，而人參的主要活性成分是人參皂苷，但是其在大腦中的作用靶蛋白尚未明確。南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究人員通過(guò)親和層析篩選與人參皂苷主要成分相互作用的蛋白，鑒定出14-3-3 ζ 蛋白為人參皂苷在腦組織中的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)生物層干涉技術(shù)BLI和等溫滴定量熱法ITC鑒定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人參皂苷的代謝物)與14-3-3 ζ 蛋白的直接相互作用。14-3-3 ζ 蛋白-PPD復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)表明，14-3-3 ζ蛋白的R56、R127和Y128殘基與部分PPD之間存在主要的相互作用，突變上述任何一個(gè)殘基都會(huì)導(dǎo)致PPD與14-3-3 ζ蛋白的親和力顯著降低。研究結(jié)果有助于更好的了解人參調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性的作用機(jī)制以及基于人參皂苷結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)與14-3-3 ζ 結(jié)合的小分子化合物。
   
 
寫(xiě)在最后     
作為技術(shù)支持的陳老濕來(lái)說(shuō)，小分子的檢測(cè)還是要說(shuō)一些丑話，小分子化合物樣品難度可比大分子大一些，因?yàn)椋?br />  

1	分子量較小，信號(hào)水平較低，容易收到非特異性等因素干擾
2	一些小分子可溶性差，真實(shí)濃度與理論濃度可能有差別
3	親和力水平跨度大，檢測(cè)濃度范圍比較寬泛
4	可能含有各種有機(jī)溶劑，這對(duì)Octet和其傳感器沒(méi)有影響，但是可能對(duì)蛋白活性有影響
	因此如果檢測(cè)方法優(yōu)化不當(dāng)?shù)脑挘瑢?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性有時(shí)不甚理想。

 
鼓吹“儀器是萬(wàn)能的”之類(lèi)的大話是沒(méi)有用的，技術(shù)專(zhuān)家同用戶(hù)分享豐富的經(jīng)驗(yàn)以及找到切實(shí)有效的解決方案才是關(guān)鍵，才能讓儀器設(shè)備變得“萬(wàn)能”。
 
最后陳老濕奉上 “神功寶典”一份《降低小分子篩選及動(dòng)力學(xué)應(yīng)用的變異性》，希望各位大俠早日神功大成，記得點(diǎn)擊下載哈！  
-參考文獻(xiàn)-
【1】Yaya Zhang, et al. Metformin interacts with AMPK through binding to c subunit. Mol Cell Biochem (2012) 368:69–76.
【2】Overacker, R.D. et al. Biolayer interferometry provides a robust method for detecting DNA binding small molecules in microbial extracts. Anal Bioanal Chem 413, 1159–1171 (2021).
【3】Li Q, et al. Corilagin inhibits SARS-CoV-2 replication bytargeting viral RNA-dependent RNA polymerase, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021.
【4】Feiyan Chen, et al.Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues,Journal of Ginseng Research,2020,1226-8453.