點突變與人類疾病

基因是很多生命的藍圖，基因突變雖有對物種的多樣性和演化有重要的作用，但同時也是很多疾病的根源。點突變就是突變類型中最常見的一種，是色盲癥、鐮刀狀細胞貧血癥、囊性纖維化以及很多腫瘤病變中的罪魁禍首。除了引發癌癥以外，一些點突變還能提高癌細胞的藥物抗性，因此針對同一靶點有時需要設計不同的藥物才能取得一致的療效。

圖1. 點突變與人類疾病。圖中突變的位點為數字表示，數字前的字母為正常氨基酸簡稱，數字后的字母為突變后的氨基酸簡稱，如果數字后沒有字母，則表示存在多種突變形式。

點突變是突變的一種，廣義的點突變包括所有單個堿基的改變，即缺失、插入和替換。而狹義的點突變則僅指單個堿基的替換。嘌呤之間和嘧啶之間的替換叫做轉換，而嘧啶與嘌呤之間的替換則叫顛換。以上說的都是DNA分子層面的改變，如果把視角擴展到染色體的層面，則存在染色體數量改變和染色體結構變異兩種。

圖2. 點突變的方式。

點突變對氨基酸及其構成的蛋白質結構和功能的影響分為三種，即同義突變、無義突變和錯義突變。一般情況下，在相同的位點，無義突變對蛋白質影響最大，錯義突變的非保守型突變次之，接下來是錯義突變中的保守型突變，同義突變本身對蛋白質功能無影響。

圖3. 點突變對氨基酸的影響。

圖4. 點突變是發生概率最高的突變方式。

據人類基因組突變數據庫統計，單堿基無義和錯義突變占人類突變總數的65%以上，這里沒有將同義突變納入統計范疇。圖中的小片段指堿基數≤20的改變，大片段則是指堿基數＞20。

研究點突變疾病的利器——點突變模式動物

依靠同源重組，可以將含有突變堿基的DNA片段整合到基因組中，但過低的重組效率以及種屬局限限制了點突變的研究。隨著各種核酸酶技術在2009-2013年之間井噴式的發展及以后的不斷完善，尤其是Crispr/Cas9技術的發明，使得基因編輯的效率大幅提高，難度和成本也顯著降低，其在點突變疾病研究中發揮著重要作用。

在目前的臨床前研究中，傳統轉基因和基因敲除動物仍然占有相當比重。但是，人類疾病中基因產物并非總是如轉基因一樣的高表達，也不是像基因敲除動物一樣完全不表達。很多情況下只是由于單個或者少數幾個堿基的改變而造成的蛋白結構改變，表現為非正常激活或者抑制。因此，構建精細的與疾病對應的點突變動物模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案。而現在的Crispr/Cas9技術也使得我們能夠以更低的成本和功能高的效率將之實現。賽業生物紅鼠庫通過對上千例Crispr項目進行深度學習，綜合gRNA切割位點、點突變位置、oligo長度、同義突變個數、所在位點Cas9切割效率以及脫靶率等因素，智能化生成gRNA設計方案。

此外針對通常條件下，細胞偏向于使用非同源末端連接的方式對斷裂的雙鏈進行修復，進而造成靶位點基因的插入/缺失突變。賽業生物團隊在 Crispr/Cas9 技術的基礎上創新性研發出 CRISPR-Pro 基因修飾技術，采用獨特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復路徑，進而提高同源重組效率。

圖5. 賽業助您構建點突變模式動物。

模式動物的基因與人類往往存在幾個堿基的差異，比如目前主流觀點中造成AD的元兇Aβ序列，小鼠與人類之間存在3個堿基的差異，而家族性AD中除了需要人源化Aβ以外，還需要將Aβ前體APP的致病堿基進行突變。此外，針對兩個距離接近的突變位點和距離遠的突變位點，也需要采用不同的打靶策略。賽業生物就不同的距離點突變動物的構建已經形成了一套成熟的體系，以最少的步驟構建出您所需要的動物，節省寶貴的研發時間。

圖6. 點突變小鼠數據庫及定制平臺。

賽業點突變模型成功案例節選

使用賽業點突變數據庫可以高效智能地設計雙gRNA切割。以阿爾茨海默病致病基因APP為例，可以通過賽業的點突變小鼠數據庫獲取該基因編碼蛋白的不同類型，根據氨基酸位點設計點突變方案，經過深度學習的系統會根據gRNA切割位點。按照圖中步驟設置即可完成設計。

圖7. 點突變設計。

基于我們的研究目的，我們將APP基因進行Aβ片段的人源化改造（改造三個位點），并引入文獻中報道能抑制Aβ產生的A673T突變，用以在動物模型中研究這個位點突變的功能。

圖8. 點突變設計。

基于上述系統，賽業已成功開發多種多點突變動物，尤其是我們以大鼠為對象構建的阿爾茨海默病相關模型，其文獻已經發表。

圖9. 賽業生物已完成多位點突變項目及發表文獻。

作為基因改變相關疾病最主要的誘因，針對點突變的研究不論是在先天的遺傳疾病還是后天突變導致的腫瘤中都具有重要的意義。要在動物身上研究人類疾病，除了致病突變以外，對蛋白關鍵位點的人源化也是藥物評價中不可或缺的，因此高效的多點突變模式動物會有更多的應用場景，我們也將不斷探索，更快更好地為客戶您提供優質的點突變模型。