追根溯源：細說靶向重測序與擴增子捕獲技術

Thermo 與 Illumina合作的消息公布之后，在生物醫學界投下了一顆重磅炸彈，Ion Ampliseq也一下子成為網絡熱搜詞。Ion Ampliseq這個技術究竟是什么？它有什么獨特之處？為什么這個技術會造成轟動性的效應呢？讓我們追根溯源，從NGS說起。

NGS，即下一代測序技術（Next-generation sequencing technology）又稱高通量測序技術（High-throughput sequencing），以能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定但讀長一般較短為標志。

NGS技術正逐年成熟，這使得全基因組測序的成本越來越低，但是對全基因組進行測序后得到的極其龐大、繁雜的數據量的分析工作并沒有隨之一起變得更加簡單，恰恰相反，更高的測序深度反而導致最后的數據量變得更加龐大了,分析工作也變得更加困難。于是，測序技術的發展出現了兩個極端的方向：一種是大而全的全基因組測序，一種是小而精的靶向重測序。

相比于全基因組測序（WGS），靶向重測序技術直接從樣品中對感興趣的基因組區域進行分離測序。這種方式能夠更加高效且經濟地發揮NGS技術的優勢，后續的分析速度也會有跨越性的提升。比如外顯子組僅占基因組的1%左右，但卻包含了絕大部分的已知致病突變，將外顯子區域分離出來后單獨進行測序，后續的分析就能降低99%的工作量，極大的加快了分析的速度。

在遺傳突變、腫瘤篩查等領域，靶向重測序所能達到的靈敏度也是全基因組測序完全無法實現的。由于靶向重測序在測序前就對基因的目標區域進行了分離與富集，目標區域的大幅減少可實現5000×甚至更高的測序深度。測序深度的提高意味著更高的靈敏度（能夠檢測低頻率的變異），其檢測極限低至0.1%。

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靶向重測序中，目標片段的富集主要由兩種方式來實現：雜交捕獲和擴增子捕獲。

○●○ 雜交捕獲技術

通過設計與目標片段互補的生物素化探針，使其與含目的基因的片段進行雜交，以達到將目的基因片段富集后進行高通量測序的目的。根據支持物的不同，探針雜交捕獲技術分為液相雜交與固相雜交兩種。固相雜交由于其在花費與操作上的劣勢，已基本被淘汰；液相雜交是在溶液中，目標片段和帶有生物素標記的探針直接雜交，然后利用被鏈霉親和素包裹的磁珠對雜交了生物素探針的片段進行吸附。洗去游離DNA后，將富集得到的DNA進行擴增，構建高通量測序文庫。

○●○ 擴增子捕獲技術

擴增子捕獲測序技術是一種目標區域高通量測序技術，利用特異性引物來對感興趣的DNA區域進行PCR擴增，形成高度富集的DNA庫，將PCR產物純化后再進行文庫構建和高通量測序。篇首所述的Ion Ampliseq技術便歸屬于擴增子捕獲技術。

擴增子捕獲測序助力臨床研究加速

對臨床或轉化研究而言，檢測不僅要準確，還要快速并且經濟。相比于擴增子捕獲法，雜交捕獲的實驗過程過于復雜繁瑣，且手動操作時間過長，過多的人工干預流程可能會對實驗結果造成不可控的影響，這對于臨床而言是非常致命的。同時，擴增子捕獲技術實驗流程的簡化極大的降低了操作人員的專業門檻，使更多的人能夠完成實驗，徹底解放了人手不足的風險。

擴增子捕獲測序作為全基因組測序的補充技術是非常有用的，它大大簡化了實驗流程和分析目標。該技術已被證明是一個快速、有效的技術，并在新一代高通量測序中發揮獨特之處，已經產生了許多令人興奮的新發現，應用領域也越來越廣泛。

獨創一步法擴增子建庫技術重塑NGS技術屬性

奇輝生物深耕靶向測序多年，通過獨創引物設計修飾技術將擴增子捕獲技術與文庫構建結合成一步反應，成功開發出EMS-Lib™一步法建庫技術，該技術均一性好，擴增子拷貝數變化在1個log以內，有效避免過度測序；特異性高，測序有效分析數據高達99%;操作便捷，單管反應，從捕獲到建庫，手工操作僅10 min。目前以EMS-Lib™一步法建庫技術為基礎，已開發出了以下Panel：