BAC文庫構(gòu)建技巧

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基因組DNA文庫有十分廣泛的用途，如用于分析、分離特定的基因片段，用以基因表達調(diào)控、人類及動植物基因組工程的研究。通常情況下，基因組文庫構(gòu)建的基本流程可以歸為4大步驟：分離基因組DNA、對基因組DNA作相關(guān)的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞。

一、分離基因組DNA（gDNA）

毫無疑問，優(yōu)質(zhì)的基因組DNA對于基因組文庫構(gòu)建是至關(guān)重要的。研究者需要查閱文獻，通過經(jīng)驗來選擇合適的基因組DNA分離方法，在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解，同時也要盡量保證DNA的純度。

二、處理基因組DNA

根據(jù)研究目的，研究者需要選擇合適的載體。不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求，研究者必須選擇合適長度的基因組DNA來構(gòu)建基因組文庫。
構(gòu)建黏粒基因組DNA文庫，研究者需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA；接著用末端修復(fù)酶修復(fù)DNA，可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段，隨后使用百博明創(chuàng)的膠回收試劑盒回收DNA。構(gòu)建BAC基因組DNA文庫，研究者需要將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）來消化基因組DNA，然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb），隨后透析回收DNA。

需要注意：

（1）電泳時，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準(zhǔn)確定位所需分子量的DNA。用百博明創(chuàng)試劑盒構(gòu)建黏粒文庫時，就可以直接采用文庫試劑盒內(nèi)的Control Insert DNA來做marker，既方便又準(zhǔn)確。

（2）電泳以后，應(yīng)該避免用紫外光照射目標(biāo)DNA，紫外光照射DNA會顯著降低克隆效率。解決方法：把marker所在的部分凝膠切下，在紫外燈下做好記號，然后以此為參考定位所需的片段。

（3）回收DNA的時候，應(yīng)該要避免過度離心，以防止DNA被剪切，降低文庫質(zhì)量。

三、載體的選擇

目前，常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體（P1人工染色體）、BAC載體（細菌人工染色體）和YAC載體（酵母人工染色體）。選用何種載體可以參考如下幾個因素：

1．目標(biāo)區(qū)域的大小

如果基因組的目標(biāo)區(qū)域很小（小于50kb），那么可以選擇黏粒載體甚至是λ噬菌體載體。利用現(xiàn)有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，研究者可以方便的構(gòu)建黏粒載體文庫。

如果基因組的目標(biāo)區(qū)域比較大，那么P1、PAC或者BAC就比較合適了。P1操作比較困難，PAC相對簡便。BAC載體也是很好的選擇，研究者可以利用現(xiàn)有的成熟產(chǎn)品來構(gòu)建BAC文庫，比如百博明創(chuàng)公司的一系列BAC載體及配套試劑盒。

如果目標(biāo)區(qū)域非常大（大于250kb），那么YAC載體就是首選了。不過，應(yīng)用YAC載體來構(gòu)建基因組文庫，操作非常繁瑣困難，一般由專門的公司來完成。

表1 各種載體的比較

載體    容量（kb）    宿主    導(dǎo)入細胞方式
黏粒    30-45       大腸桿菌     轉(zhuǎn)導(dǎo)
P1      70-100      大腸桿菌     轉(zhuǎn)導(dǎo)
PAC     130-150     大腸桿菌     電轉(zhuǎn)
BAC     120-300     大腸桿菌     電轉(zhuǎn)
YAC     250-400       酵母       轉(zhuǎn)化

2．篩選文庫的難易程度

黏粒載體一般使用傳統(tǒng)的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對于構(gòu)建區(qū)域圖譜及疊連群來說既費力又浪費。大容量載體文庫，如P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統(tǒng)的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用PCR進行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構(gòu)建文庫，可以減少染色體步查的步驟。

3.載體拷貝數(shù)的考慮：

當(dāng)把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時，克隆DNA會發(fā)生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩(wěn)定性；而單拷貝載體的低產(chǎn)量DNA是高通量分析的瓶頸。這個矛盾常常困擾著研究者。 百博明創(chuàng)多年來研發(fā)的克隆系統(tǒng)是對這些困難的最好的解決方案。該系統(tǒng)整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優(yōu)點。單拷貝載體能提高插入片段的穩(wěn)定性，而且拷貝載體能在誘導(dǎo)劑的作用下，即時擴增出高拷貝數(shù)的克隆而獲得高產(chǎn)量的DNA。

四、將基因組DNA片段連接入載體

使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體。百博明創(chuàng)擁有自己的商業(yè)化載體，已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理，可以直接使用，無需內(nèi)切酶消化及脫磷酸化處理。百博明創(chuàng)研發(fā)的連接酶具有連接快、效率高等優(yōu)點。

五、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞

如果使用百博明創(chuàng)試劑盒構(gòu)建黏粒文庫，首先包裝上述的連接反應(yīng)產(chǎn)物，測定包裝好的黏粒克隆的滴度，然后轉(zhuǎn)染。挑出重組子，鑒定插入片段的大小。如果文庫的大小和質(zhì)量都令人滿意的話,就可以鋪板進行文庫篩選，或者擴增、保存文庫。如果使用百博明創(chuàng)試劑盒構(gòu)建BAC文庫，應(yīng)選擇電轉(zhuǎn)法，可以選擇百博明創(chuàng)Electrocompetent E.coli 作為宿主，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細菌，涂板長出克隆后。獲得克隆，研究者需要對BAC克隆的大小進行評估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。百博明創(chuàng)文庫構(gòu)建試劑盒可以方便的鑒定出BAC克隆的大小，從而估計出BAC文庫的大小。如果文庫大小合適，那么這個文庫就可以進行后續(xù)的操作了。

六、文庫克隆數(shù)的確定

基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經(jīng)驗公式來確定：

N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆蓋率，f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值，N是所需的克隆數(shù)。

舉例來說，用BAC載體構(gòu)建人類基因組文庫，人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb，希望覆蓋率99%，那么所需要的BAC克隆數(shù)為N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [105bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298

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