李靜

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

TSQ Quantiva；肽段定量；靈敏度

 

生物標志物的研究包括發現（Discovery），驗證（Verification），確認（Validation） 階段， 最后進入臨床檢驗（Clinical Utilization）等更深入的階段。在研究生物標志物的過程中，主要的挑戰在于如何在成分復雜的生物樣品中發現中等豐度或低豐度的蛋白質，這就對儀器性能提出了很高的要求，即儀器必須具備高靈敏度，以保證低豐度蛋白質的檢出。

 

TSQ Quantiva 是賽默飛世爾科技在2013 年ASMS 上推出的全新一代三重四極桿質譜儀。TSQ Quantiva 采用主動離子管控技術(Active Ion Management，AIM)（圖1）技術優化離子生成及從離子源至檢測器的傳輸，使這款儀器能夠以最優異的靈敏度定量分析最復雜和最具挑戰性的樣品。本實驗旨在考查TSQ Quantiva 在復雜基質中針對目標肽段定量的靈敏度。

 

 

圖1. 主動離子管控技術（AIM）示意圖

 

PIERCE Peptide Retention Time Calibration Mixture（貨號: 88320），內含15 條不同疏水系數（Hydrophobicity Factor, HF）的重標肽段。采用5ng/μL E.coli 酶解產物進行逐級稀釋，獲得濃度為0.0005 fmol/ μL, 0.0025 fmol/ μL, 0.005 fmol/ μL, 0.05 fmol/μL, 0.5 fmol/ μL, 5 fmol/ μL, 50 fmol/ μL 的樣品。實驗中通過Pinpoint 1.3 軟件進行離子對的選擇（圖2），每個母離子選擇4 個子離子，其中1 個子離子作為定量離子，3 個子離子作為定性離子。最終建立了15 條目標肽段，共計60個離子對的SRM 方法，其中加粗部分為定量離子（表1）。

 

圖2. Pinpoint 1.3 軟件進行離子對的選擇

 

表1. 15 條肽段信息

 

 

高效液相色譜儀: Thermo Scientific EASY-nLC 1000

預柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（2cm, ID75μm, 3μm）

分析柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（15cm, ID75μm, 3μm）

流動相：A，含0.1% 甲酸的水溶液；B，含0.1% 甲酸的乙腈溶液

梯度： 2%-5% B 2 min，2%-45% B 42min，45%-90% B 3 min，90%B 3min

流速：300 nL/min

上樣量: 2 μL

 

質譜儀：Thermo Scientific TSQ Quantiva

離子源：NanoFlex 離子源

離子模式：正離子

噴霧電壓：2.0 KV

毛細管溫度：275 ℃

Q1 and Q3 resolution: 0.7 Da;

Cycle time：2s

碰撞能量：通過公式CE=0.034 × 母離子的m/z + 5.314 計算得到相應肽段的碰撞能量，并在此基礎上CE加減2 進行進一步優化，選擇最優碰撞能量。

 

本實驗采用全新一代三重四極桿質譜TSQ Quantiva 對復雜基質中15 條重標肽段進行定量分析，均可獲得良好的色譜峰形和質譜響應（圖3）。以肽段SSAAPPPPPR* 為例，檢出限為（LOD）1amol，定量下限（LLOQ）為5amol（圖4）。如圖5 標準曲線所示，在5amol-100fmol 五個數量級濃度范圍內，濃度與峰面積的線性相關系數在0.99 以上，同時，在amol 級水平仍可獲得良好重復性（圖6）。15 條肽段的標準曲線和線性范圍參見表2。

 

 

圖3. 15 條肽段總離子流圖（TIC）（上樣量100fmol）

 

 

圖4. 肽段SSAAPPPPPR* 不同上樣量提取離子流圖（EIC）m/z493.8-> m/z 335.7

 

 

圖5. 肽段SSAAPPPPPR* 標準曲線

 

 

圖6. 肽段SSAAPPPPPR* 在amol 水平重復性

 

表2. 15 條肽段標曲和線性范圍

 

 

實驗表明，得益于主動離子管控技術（AIM），TSQ Quantiva在復雜基質中針對目標肽段的定量靈敏度表現突出，極大地提升了TSQ 質譜平臺定量復雜基質中目標肽段的能力，適用于復雜生物學樣本中低豐度蛋白質的分析，可用于潛在生物標志物的確證工作。