摘要
在肝細胞中同時表達加強型黃色熒光蛋白（EYFP）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）雙基因，以探討其在肝細胞功能研究中的應用。實驗采用某品牌電穿孔儀進行轉染，并通過熒光顯微鏡觀察EYFP表達，同時利用ELISA檢測VEGF蛋白水平。結果表明，雙基因共轉染效率高，為肝細胞基因功能研究提供了可靠工具。
引言
肝細胞作為肝臟的主要功能細胞，在代謝、解毒及合成等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，基因轉染技術已成為研究肝細胞功能的重要手段。加強型黃色熒光蛋白（EYFP）作為一種常用的報告基因，能夠直觀地反映基因表達情況；而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）則在血管生成及細胞增殖中起關鍵作用。本研究通過共轉染技術，將EYFP與VEGF雙基因?qū)�入肝細胞，旨在建立一種高效的雙基因表達系統(tǒng)，為肝細胞功能研究提供新的實驗方法。
實驗部分
1. 材料與儀器
1.1 細胞培養(yǎng)
實驗采用人肝癌細胞系HepG2，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2 質(zhì)粒構建
EYFP基因與VEGF基因分別克隆至某試劑提供的pCDNA3.1載體中，構建重組質(zhì)粒pCDNA3.1-EYFP和pCDNA3.1-VEGF。質(zhì)粒通過某品牌分子雜交儀進行純化，濃度測定后備用。
1.3 主要儀器
某品牌電穿孔儀（威尼德）：用于細胞轉染。
 
熒光顯微鏡（某品牌）：用于觀察EYFP表達。
 
紫外交聯(lián)儀（威尼德）：用于DNA交聯(lián)實驗。
 
原位雜交儀（威尼德）：用于基因表達定位。
 
ELISA檢測儀（某品牌）：用于VEGF蛋白定量。
2. 實驗方法
2.1 細胞轉染
將HepG2細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到80%時進行轉染。取1 μg pCDNA3.1-EYFP與1 μg pCDNA3.1-VEGF混合，加入某試劑提供的轉染試劑中，輕輕混勻后室溫靜置15分鐘。將混合液加入細胞培養(yǎng)孔中，使用某品牌電穿孔儀進行轉染，參數(shù)設置為電壓200 V，脈沖時間10 ms。轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
2.2 熒光顯微鏡觀察
轉染24小時后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次。在熒光顯微鏡下觀察EYFP表達情況，激發(fā)波長為514 nm，發(fā)射波長為527 nm。拍照記錄熒光強度及分布。
2.3 VEGF蛋白檢測
收集轉染后的細胞上清液，使用某試劑提供的ELISA試劑盒檢測VEGF蛋白濃度。具體操作按照試劑盒說明書進行，使用某品牌ELISA檢測儀讀取吸光度值，計算VEGF濃度。
2.4 統(tǒng)計學分析
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，結果以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3. 結果
3.1 轉染效率
熒光顯微鏡下可見轉染后的HepG2細胞中EYFP表達明顯，熒光強度較高，表明轉染效率達到預期。
3.2 VEGF表達
ELISA檢測結果顯示，轉染組細胞上清液中VEGF蛋白濃度顯著高于未轉染組（P<0.05），表明VEGF基因成功表達并分泌至細胞外。
4. 討論
本研究成功建立了肝細胞雙基因共轉染系統(tǒng)，通過EYFP與VEGF的共表達，為肝細胞功能研究提供了新的實驗工具。實驗結果表明，某品牌電穿孔儀在轉染過程中表現(xiàn)出高效性和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究奠定了基礎。
5. 結論
本研究通過共轉染技術實現(xiàn)了肝細胞中EYFP與VEGF雙基因的高效表達，為肝細胞功能研究提供了可靠的方法。未來可進一步探討雙基因共表達在肝細胞代謝及血管生成中的作用。
參考文獻
1.王金林,周曉東,閔軍,等.血管內(nèi)皮生長因子基因轉染對肝細胞移植的影響[J].中華肝臟病雜志.2001,(3).DOI:10.3760/j.issn:1007-3418.2001.03.016 .
2.劉彥文,盧春彬,林勇,等.綠色熒光蛋白基因GFP真核表達載體PCT K GFP的構建[J].中山醫(yī)科大學學報.1999,(0S1).8-10.
3.Dabbah B,Kraizer Y,Baruch Y,等.Effect of vascular endothelial growth factor on hepatic regenerative activity following partial hepatectomy in rats.[J].Journal of Hepatology: The Journal of the European Association for the Study of the Liver.1999,30(5).
4.T. Tokiwa,X-D. Zhou,J. Kano.Isolation and primary culture of adult pig hepatocytes[J].Methods in Cell Science.1998,19(4).
5.Chalfie, Martin,Tu, Yuan.Green fluorescent protein as a marker for gene expression.[J].科學（上海）.1994,263(5148).802.
6.Yoshifumi Watanabe,,Hirokazu Nomoto,,Ryuichi Takezawa,,等.Highly Efficient Transfection into Primary Cultured Mouse Hepatocytes by Use of Cation-Liposomes: An Application for Immunization[J].The Journal of Biochemistry.1994,116(6).1220-1226.