本文原創(chuàng)：生物奇跡 本文來源：細胞基因研究圈

CRISPR - Cas9 系統(tǒng)概述

CRISPR - Cas9 是一種源自細菌免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)。CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復序列）是細菌基因組中的一段特殊 DNA 序列，Cas9 是一種能夠切割 DNA 雙鏈的核酸內(nèi)切酶。在基因編輯過程中，引導 RNA（gRNA）將 Cas9 引導至目標 DNA 序列位置，隨后 Cas9 對目標 DNA 進行切割。

1.敲入（Knock - in）概念

基因敲入是一種將外源基因或經(jīng)過修飾的基因序列精準插入基因組特定位置的技術(shù)。與基因敲除（Knock - out）不同，基因敲入的目的是在基因組中添加或改變基因信息。

2.CRISPR - Cas9 敲入的原理

首先，需要精心設(shè)計合適的 gRNA。gRNA 具有特異性識別并結(jié)合到基因組中目標敲入位點附近 DNA 序列的能力。在 gRNA 的引導作用下，Cas9 蛋白會在目標位點對 DNA 雙鏈進行切割，從而產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（DSB）。

當細胞內(nèi)出現(xiàn) DSB 時，細胞會啟動自身的 DNA 損傷修復機制，而該機制主要包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR）這兩種途徑。在基因敲入的過程中，主要借助的是 HDR 途徑。

與此同時，向細胞中提供含有目的基因序列的供體 DNA 模板，該模板的兩端設(shè)計有與 DSB 位點兩側(cè)具有同源性的序列。在 HDR 過程中，細胞會以供體 DNA 模板作為參考，將目的基因序列精準地整合到基因組的切割位點處，進而成功實現(xiàn)基因敲入。

圖1. 基因敲入原理圖

3.CRISPR - Cas9 敲入的步驟

設(shè)計 gRNA 和供體 DNA 模板

為了確保基因編輯的精準性，gRNA 的設(shè)計必須具備高度的特異性，從而能夠精確地引導 Cas9 蛋白到達目標位點。借助生物信息學工具，可以高效地篩選出合適的 gRNA 序列，以最大限度地降低脫靶效應的發(fā)生概率。在供體 DNA 模板的設(shè)計方面，需要包含目的基因以及與目標位點兩側(cè)具有同源性的序列。通常情況下，同源臂的長度大致在幾百個堿基對的范圍內(nèi)，然而，其具體長度還需依據(jù)實驗的具體需求、細胞類型以及其他相關(guān)因素來綜合確定。

構(gòu)建 CRISPR - Cas9 敲入載體系統(tǒng)

將 Cas9 蛋白編碼基因和 gRNA 序列整合到適合的載體中，例如質(zhì)粒載體。與此同時，供體 DNA 模板可以構(gòu)建到另一個獨立的載體中，或者通過其他方法（如寡核苷酸等）引入細胞中。

細胞轉(zhuǎn)染或其他導入方式

將構(gòu)建完成的CRISPR-Cas9載體系統(tǒng)及供體DNA模板導入目標細胞。常用的導入方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔等。不同細胞類型對導入方法的敏感性各異，因此需根據(jù)具體細胞類型選擇適宜的導入手段，以提升導入效率。

篩選和鑒定敲入細胞

若載體攜帶篩選標記基因，可借助抗生素篩選標記來富集可能發(fā)生基因敲入的細胞群體；此外，熒光標記等其他篩選手段亦可用于此目的。隨后，運用PCR、Southern雜交、測序等技術(shù)對篩選出的細胞進行鑒定分析，以確認目的基因是否精準地整合至預定的基因組位點。

4.應用領(lǐng)域

生物醫(yī)學研究

在疾病模型構(gòu)建方面，例如在細胞或動物模型中敲入與疾病相關(guān)的基因突變，可用于研究疾病的發(fā)病機制。以小鼠模型為例，通過敲入人類致病基因，能夠模擬人類遺傳性疾病的發(fā)病過程，從而為藥物研發(fā)和治療方案的探索提供重要的基礎(chǔ)。

基因治療

該技術(shù)有望應用于單基因遺傳病的治療。例如，通過將正常基因精準敲入患者細胞基因組，可糾正致病基因的缺陷。然而，基因治療在臨床應用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如安全性、免疫反應等問題。

農(nóng)業(yè)育種

該技術(shù)可用于農(nóng)作物品種改良。例如，通過敲入抗蟲、抗病、抗逆等基因，可提升農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。