隨著過去一個世紀(jì)以來開發(fā)出的廣泛熒光工具，設(shè)計實(shí)驗(yàn)時獲得高質(zhì)量的圖像可能會讓人感覺無所適從。本文將從活體熒光成像的基本原理、應(yīng)用領(lǐng)域，以及常見技術(shù)難題的解決方案，幫助研究人員更好地設(shè)計實(shí)驗(yàn)、獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

熒光成像的實(shí)驗(yàn)步驟
● 用熒光報告基團(tuán)/熒光染料進(jìn)行標(biāo)記（注射入小鼠體內(nèi)）。
● 小鼠經(jīng)過麻醉后放入成像暗箱平臺，照明燈拍攝第一次背景。
● 照明燈自動關(guān)閉，動物成像。
常用熒光染料：DIR、DID、CY5、CY5.5

活體動物熒光成像標(biāo)記的分類

熒光成像基礎(chǔ)
1. 熒光基團(tuán)（fluorophores）
熒光基團(tuán)是一類能吸收特定波長的光并發(fā)出熒光的分子或分子部分。它們是熒光染料、熒光蛋白和熒光探針等熒光物質(zhì)的核心組成部分。
2. 熒光染料（fluorescent dyes）
熒光染料是一類具有熒光性質(zhì)的有機(jī)化合物。熒光染料通常由以下部分組成：
熒光基團(tuán)：吸收光能并發(fā)出熒光的分子部分，通常具有共軛體系。
連接基團(tuán)：連接熒光基團(tuán)和靶分子的分子部分。
3. 熒光配體（fluorescent ligands）
熒光配體是一類與金屬離子或其他分子特異性結(jié)合的分子，在結(jié)合后會產(chǎn)生熒光信號。熒光配體通常由以下幾個部分組成：
配位基團(tuán)：與金屬離子或其他分子結(jié)合的官能團(tuán)。
熒光基團(tuán)：吸收光能并發(fā)出熒光的分子部分。
連接基團(tuán)：連接配位基團(tuán)和熒光基團(tuán)的分子部分。

熒光成像中的挑戰(zhàn)和解決方案
小動物活體成像儀器在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用日益廣泛，對熒光樣品進(jìn)行成像時，有一些問題需要考慮，包括生物自發(fā)熒光、儀器性能、結(jié)果可靠性等。

1.穿透深度不足——選擇合適的熒光模塊/熒光標(biāo)記
在生物組織內(nèi)，光的傳播受到散射和吸收的限制，使得深層組織結(jié)構(gòu)和過程的成像變得困難。妨礙了對體內(nèi)病理變化的深入研究。
熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在小動物活體成像系統(tǒng)中具體體現(xiàn)為熒光光源和發(fā)射光濾光片兩個關(guān)鍵部件。

● 熒光光源
勤翔小動物活體成像系統(tǒng)支持LED和激光光源，覆蓋幾乎所有市面上的熒光基團(tuán)。
近紅外 LED 光源能夠更深地穿透生物組織，從而提升成像深度。它的非侵入性特點(diǎn)減少了對樣本的影響，產(chǎn)生的背景干擾較少，有助于提高圖像的清晰度，提供更為準(zhǔn)確的成像結(jié)果。

激光光源的高亮度和方向性允許光穿透更深的組織，實(shí)現(xiàn)深層成像，獲得小動物體內(nèi)更深層的生物過程。激光可以針對特定的熒光團(tuán)進(jìn)行選擇性激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)特定生物過程的成像，例如上轉(zhuǎn)化成像。激光激發(fā)能夠產(chǎn)生高對比度圖像，非常適合于活體熒光激發(fā)。

● 發(fā)射光濾光片
發(fā)射濾光片允許熒光基團(tuán)發(fā)射的特定波段的光通過。在熒光成像中用于精確選擇和增強(qiáng)特定波段的信號，通過適當(dāng)?shù)耐高^率和截止特性，可以有效提高成像質(zhì)量，減少背景干擾。

● 熒光染料
染料的亮度因其各自熒光色素的不同而變化，受激發(fā)系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的雙重影響。不同染料與同一蛋白質(zhì)使用時可導(dǎo)致背景信號的變化（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。
FITC和DiR都是常見染料，用于標(biāo)記蛋白質(zhì)時，DiR的激發(fā)波長更長，能夠更深地穿透組織，成像結(jié)果更好。

2. 背景熒光過高-樣品準(zhǔn)備和先進(jìn)的算法校正
組織的自發(fā)熒光以及非特異性染料結(jié)合所產(chǎn)生的信號，會產(chǎn)生背景干擾。這些非特異信號會掩蓋實(shí)際的熒光信號，導(dǎo)致結(jié)果變得模糊不清，影響實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。
為了更好地控制背景熒光，研究人員開發(fā)了多種策略。包括選擇與自發(fā)熒光波長差異較大的熒光標(biāo)記物，使用數(shù)學(xué)算法進(jìn)行圖像處理等方法以減少影響。（Nicholas Billinton et al.，2001）

● 自發(fā)熒光
自發(fā)熒光來自于結(jié)構(gòu)成分，從小分子到更大的結(jié)構(gòu)。生物的自發(fā)熒光峰值位于500nm左右，主要由毛發(fā)、皮膚、肌肉、血紅蛋白等引起。使用近紅外光源激發(fā)小動物活體成像，可以避開這些自發(fā)熒光干擾，獲得更高的信噪比的圖像。


● 剔除毛發(fā)
未剃毛的C57BL/6小鼠皮下腫瘤的生物發(fā)光信號強(qiáng)度比植入到Albino B6或NMRI Nude小鼠上的相似腫瘤信號低。（Liesa-Marie Schreiber et al.，2019）
至少提前一天進(jìn)行脫毛或剃毛，使用鋒利的刀片，沖洗脫毛或剃毛區(qū)域，并用無菌紗布輕輕擦拭，去除任何殘留物。

● 飼料熒光
如果需要進(jìn)行消化道成像，至少提前一周使用無熒光飼料喂養(yǎng)動物，以避免苜蓿素的熒光干擾。（Yusuke et al., 2008）

3. 靈敏度不足——更高端的硬件
對于涉及低豐度分子或信號較弱的探針，活體成像的靈敏度常常顯得不足。這使得檢測目標(biāo)分子信號變得極為困難，未能及時捕捉到關(guān)鍵的信號可能會導(dǎo)致研究結(jié)果的偏差。
提高成像系統(tǒng)靈敏度依賴于兩個關(guān)鍵組件：鏡頭和感光芯片。通過優(yōu)化這兩個組件，勤翔小動物成像系統(tǒng)成功提升靈敏度，提供更可靠、更精確的活體成像工具。

● 鏡頭
鏡頭光圈決定透光能力，勤翔小動物活體成像系統(tǒng)采用f/0.8大光圈鏡頭，相比常見的f/0.95鏡頭，透光能力提升30%，成像時間更短，獲得更清晰圖像。

● 感光芯片
感光芯片的性能也影響靈敏度，其理想特性包括更大感光面積、像素尺寸、量子效率，以及更低的暗電流和背景噪聲。這些特性協(xié)同提升信噪比，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量成像。

4. 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性問題——專業(yè)的采集分析軟件
圖像質(zhì)量和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性可能受到多種因素的干擾。這些問題不僅影響了圖像的清晰度，也可能導(dǎo)致誤判和數(shù)據(jù)分析上的錯誤，妨礙結(jié)論的可靠性。
勤翔小動物活體成像軟件集成了強(qiáng)大的專用成像和分析模塊。成像模塊支持實(shí)時預(yù)覽、全自動控制，確保圖像數(shù)據(jù)的完整性和一致性。分析模塊采用先進(jìn)算法，支持背景扣除、圖像增強(qiáng)和定量分析單位p/s/cm²/sr，進(jìn)一步提高了圖像數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。軟件通過直觀的界面將這些功能集成在一起，消除人為錯誤的可能性，確保了成像結(jié)果的高度可重復(fù)性。

5. 信息單一，信號不易定位——多維成像
傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)通常只能提供單一模態(tài)的信息，缺乏多維度的綜合表征。在精確定位信號源方面的明顯不足，限制了對生物系統(tǒng)復(fù)雜交互作用的全面理解。
熒光成像提供了功能成像，揭示了生物過程的動態(tài)變化，例如基因表達(dá)、細(xì)胞活動和代謝。X射線成像則能提供結(jié)構(gòu)信息，展示解剖結(jié)構(gòu)。

結(jié)論
通過利用熒光標(biāo)記和成像系統(tǒng)，研究人員能夠可視化和量化小動物體內(nèi)特定分子、細(xì)胞和組織的分布及其動態(tài)行為。為了確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，本文提供了一些解決方案，以提升實(shí)驗(yàn)的信噪比、分辨率和特異性。