淚腺RRBS+RNA-seq揭示Sjögren綜合征相關(guān)干眼癥的潛在基因
Sjögren綜合征（Sjögren’s syndrome，SS）相關(guān)干眼癥是一種以淚腺（lacrimal glands，LGs）慢性炎癥為特征的難治性自身免疫性疾病，表觀遺傳因子在SS相關(guān)干眼癥發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。然而，淚腺中的DNA甲基化變化及其在SS相關(guān)干眼癥發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。
近日，天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院韋燕凱和孫梅為共同第一作者、魏瑞華教授為通訊作者，在《Journal of Inflammation Research》雜志（發(fā)表題為“Integrated DNA Methylation and Transcriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential Genes Implicated in the Development of Sjögren’s Syndrome-Related Dry Eye”的研究論文，研究對淚腺中的DNA甲基化和RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析以鑒定SS相關(guān)干眼癥發(fā)病機(jī)制中的新型DNA甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因（MeDEGs）。揭示了SS相關(guān)干眼癥的表觀遺傳因子，尤其是DNA甲基化在淚腺（LGs）中的變化及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。
研究方法：
研究結(jié)果：
RRBS分析結(jié)果表明，隨著SS相關(guān)干眼癥的發(fā)展，NOD小鼠淚腺中的DNA甲基化水平增加，且主要在GTP酶激活和Ras信號通路中富集。RNA-Seq分析結(jié)果表明，與4周正常對照小鼠相比，8、12和16周齡的NOD小鼠分別有1321、2549和3712個(gè)DEGs；GO分析揭示DEGs主要富集在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中。通過甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的綜合關(guān)聯(lián)分析共鑒定出140個(gè)MeDEGs，主要富集在T細(xì)胞激活、增殖和分化。基于MeDEGs的GO和KEGG通路分析篩選出8個(gè)關(guān)鍵基因，尤其是Itgal、Vav1、Irf4和Icosl這些關(guān)鍵基因，在NOD小鼠SS相關(guān)干眼癥發(fā)病后表達(dá)水平升高，并與淚腺中炎癥細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)。免疫熒光分析表明，與對照組小鼠相比，SS相關(guān)干眼癥小鼠的淚腺中CD4+細(xì)胞浸潤顯著增加。MSP驗(yàn)證結(jié)果表明，與對照組相比，SS相關(guān)干眼癥NOD小鼠中Irf4和Itgal啟動子低甲基化。
本研究研究結(jié)果揭示了T細(xì)胞免疫相關(guān)基因的表觀遺傳調(diào)控在SS相關(guān)干眼癥進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，并表明了DNA甲基化調(diào)控基因如Itgal、Vav1、Irf4和Icosl可能作為SS相關(guān)干眼癥治療的新靶點(diǎn)。
關(guān)鍵圖形：
（1）NOD小鼠在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中淚腺的DNA甲基化水平增加
RRBS文庫質(zhì)控、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率和比對率
(B) 不同NOD小鼠組淚腺中C位點(diǎn)的基因組覆蓋率。
(C) 單個(gè)胞嘧啶的主要成分分析（PCA）。
(D) CG位點(diǎn)甲基化水平的分層聚類（HC）分析。
(E) NOD小鼠不同SS相關(guān)干眼癥階段淚腺中所有C位點(diǎn)的整體DNA甲基化水平。
(F) 不同組中CG位點(diǎn)甲基化水平的分布。
(G) NOD小鼠不同疾病階段CG位點(diǎn)的甲基化率。
(H) 所有基因的基因體、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游2 kb以及轉(zhuǎn)錄結(jié)束位點(diǎn)（TES）下游2kb處的DNA甲基化水平。
(I) 啟動子CG島及其周圍區(qū)域的DNA甲基化水平。
(J) 基因功能區(qū)域中CG位點(diǎn)甲基化水平熱圖。紅色代表高甲基化；藍(lán)色代表低甲基化。
（2）SS相關(guān)干眼癥小鼠LG中鑒定的差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因（DMGs）的功能富集
(B-D) 不同階段SS相關(guān)干眼癥的不同染色體DMRs比較。
(E-G) 不同年齡段NOD小鼠組中鑒定的DMRs基因組位點(diǎn)（外顯子和啟動子）條形圖。
(H) 對DMGs進(jìn)行GO富集分析。
(I) 對DMGs進(jìn)行TOP 10的KEGG通路分析。
(J-L) SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中，qRT-PCR確定淚腺中Dnmt1（J）、Dnmt3a（K）和Dnmt3b（L）變化。每組n=3。
（3）LGs在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)錄組分析
RNA-Seq文庫的基本測序質(zhì)控和圖譜率
圖3：在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中淚腺的轉(zhuǎn)錄組分析。
(A) 所有樣本clean reads的比對率。
(B-C) 基于不同組的基因表達(dá)進(jìn)行的主成分分析（PCA）和分層聚類（HC）。
(D) 每組中差異表達(dá)基因（DEGs）熱圖。
(E) 三個(gè)組中上調(diào)DEGs的維恩圖。
(F-H) 對重疊上調(diào)DEGs的GO富集分析。根據(jù)細(xì)胞組分（CC）(F)、生物過程（BP）(G) 和分子功能（MF）(H) 對預(yù)測基因進(jìn)行GO分析。
(I) 對DEGs的KEGG通路分析。總結(jié)了前20條通路。
（4）DMR與全基因組基因表達(dá)的相關(guān)性分析
（B） 低甲基化 DMR 上調(diào) DEG 的 VENN 分析。
（C -D） 不同 NOD 組中啟動子低甲基化上調(diào)基因的 GO 和 KEGG 分析。
（5）與SS相關(guān)干眼癥相關(guān)關(guān)鍵DNA甲基化調(diào)控基因的鑒定
(B) 與SS相關(guān)干眼癥相關(guān)的候選功能基因的啟動子甲基化水平和表達(dá)水平熱圖。
(C) qRT-PCR驗(yàn)證淚腺中候選基因的mRNA表達(dá)水平。每組n=3。
(D) 候選基因表達(dá)水平與淚腺中淋巴細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性分析。
(E) 4、8、12和16周齡組淚腺中DAPI和CD4+的免疫熒光標(biāo)記。
(F) 候選基因表達(dá)水平與淚腺中CD4+細(xì)胞浸潤程度之間的相關(guān)性分析。
(G) 與對照組4周齡小鼠相比，SS相關(guān)干眼癥NOD小鼠Icosl（n=3）、Irf4（n=3）、Vav1（n=3）和Itgal（n=3）基因的MSP表征。
易小結(jié)
本研究通過RRBS+RNA-seq的綜合分析揭示了在NOD小鼠SS相關(guān)干眼癥的發(fā)展過程中，淚腺的基因組DNA甲基化水平增加。NOD小鼠淚腺中上調(diào)的Itgal、Icosl、Vav1和Irf4基因與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，可能在SS相關(guān)干眼癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，Itgal和Irf4啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平降低，可能是SS相關(guān)干眼癥中Itgal和Irf4上調(diào)的原因。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助進(jìn)一步理解SS相關(guān)干眼癥的病因，并為SS相關(guān)干眼癥的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Sun M, Wei Y, Zhang C, Nian H, Du B, Wei R. Integrated DNA Methylation and Transcriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential Genes Implicated in the Development of Sjögren's Syndrome-Related Dry Eye. J Inflamm Res. 2023;16:5697-5714. pii: 440263. doi: 10.2147/JIR.S440263. PubMed PMID: 38050559.
近日，天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院韋燕凱和孫梅為共同第一作者、魏瑞華教授為通訊作者，在《Journal of Inflammation Research》雜志（發(fā)表題為“Integrated DNA Methylation and Transcriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential Genes Implicated in the Development of Sjögren’s Syndrome-Related Dry Eye”的研究論文，研究對淚腺中的DNA甲基化和RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析以鑒定SS相關(guān)干眼癥發(fā)病機(jī)制中的新型DNA甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因（MeDEGs）。揭示了SS相關(guān)干眼癥的表觀遺傳因子，尤其是DNA甲基化在淚腺（LGs）中的變化及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。
研究方法：
- 樣本選擇：雄性非肥胖糖尿病小鼠（NOD / ShiLtJ）vs 年齡匹配的雄性對照BALB/c小鼠。
- 測序技術(shù)：利用簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）和RNA測序（RNA-Seq）技術(shù)，分析了不同年齡階段（4、8、12和16周齡）的SS相關(guān)干眼癥NOD小鼠淚腺的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組圖譜。
- 關(guān)聯(lián)分析：分析了差異甲基化基因（DMGs）和差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行甲基化水平與mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析。GO和KEGG分析DMGs和DEGs的功能相關(guān)性。
- 驗(yàn)證研究：MSP和qRT-PCR驗(yàn)證關(guān)鍵基因的甲基化和表達(dá)水平。免疫熒光染色檢測淚腺中CD4+細(xì)胞浸潤。
研究結(jié)果：
RRBS分析結(jié)果表明，隨著SS相關(guān)干眼癥的發(fā)展，NOD小鼠淚腺中的DNA甲基化水平增加，且主要在GTP酶激活和Ras信號通路中富集。RNA-Seq分析結(jié)果表明，與4周正常對照小鼠相比，8、12和16周齡的NOD小鼠分別有1321、2549和3712個(gè)DEGs；GO分析揭示DEGs主要富集在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中。通過甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的綜合關(guān)聯(lián)分析共鑒定出140個(gè)MeDEGs，主要富集在T細(xì)胞激活、增殖和分化。基于MeDEGs的GO和KEGG通路分析篩選出8個(gè)關(guān)鍵基因，尤其是Itgal、Vav1、Irf4和Icosl這些關(guān)鍵基因，在NOD小鼠SS相關(guān)干眼癥發(fā)病后表達(dá)水平升高，并與淚腺中炎癥細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)。免疫熒光分析表明，與對照組小鼠相比，SS相關(guān)干眼癥小鼠的淚腺中CD4+細(xì)胞浸潤顯著增加。MSP驗(yàn)證結(jié)果表明，與對照組相比，SS相關(guān)干眼癥NOD小鼠中Irf4和Itgal啟動子低甲基化。
本研究研究結(jié)果揭示了T細(xì)胞免疫相關(guān)基因的表觀遺傳調(diào)控在SS相關(guān)干眼癥進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，并表明了DNA甲基化調(diào)控基因如Itgal、Vav1、Irf4和Icosl可能作為SS相關(guān)干眼癥治療的新靶點(diǎn)。
關(guān)鍵圖形：
（1）NOD小鼠在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中淚腺的DNA甲基化水平增加
RRBS文庫質(zhì)控、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率和比對率
圖1：在NOD小鼠SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中淚腺的DNA甲基化水平增加。
(A) RRBS技術(shù)繪制4、8、12和16周齡NOD小鼠不同階段SS相關(guān)干眼癥中CG、CHG和CHH的DNA甲基化率。(B) 不同NOD小鼠組淚腺中C位點(diǎn)的基因組覆蓋率。
(C) 單個(gè)胞嘧啶的主要成分分析（PCA）。
(D) CG位點(diǎn)甲基化水平的分層聚類（HC）分析。
(E) NOD小鼠不同SS相關(guān)干眼癥階段淚腺中所有C位點(diǎn)的整體DNA甲基化水平。
(F) 不同組中CG位點(diǎn)甲基化水平的分布。
(G) NOD小鼠不同疾病階段CG位點(diǎn)的甲基化率。
(H) 所有基因的基因體、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游2 kb以及轉(zhuǎn)錄結(jié)束位點(diǎn)（TES）下游2kb處的DNA甲基化水平。
(I) 啟動子CG島及其周圍區(qū)域的DNA甲基化水平。
(J) 基因功能區(qū)域中CG位點(diǎn)甲基化水平熱圖。紅色代表高甲基化；藍(lán)色代表低甲基化。
（2）SS相關(guān)干眼癥小鼠LG中鑒定的差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因（DMGs）的功能富集
圖2：SS相關(guān)干眼癥小鼠淚腺中鑒定的DMGs功能富集分析。
（A） 8、12和16周齡NOD小鼠與4周齡對照組在CG的DMRs數(shù)比較。(B-D) 不同階段SS相關(guān)干眼癥的不同染色體DMRs比較。
(E-G) 不同年齡段NOD小鼠組中鑒定的DMRs基因組位點(diǎn)（外顯子和啟動子）條形圖。
(H) 對DMGs進(jìn)行GO富集分析。
(I) 對DMGs進(jìn)行TOP 10的KEGG通路分析。
(J-L) SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中，qRT-PCR確定淚腺中Dnmt1（J）、Dnmt3a（K）和Dnmt3b（L）變化。每組n=3。
（3）LGs在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)錄組分析
RNA-Seq文庫的基本測序質(zhì)控和圖譜率
圖3：在SS相關(guān)干眼癥發(fā)展過程中淚腺的轉(zhuǎn)錄組分析。
(B-C) 基于不同組的基因表達(dá)進(jìn)行的主成分分析（PCA）和分層聚類（HC）。
(D) 每組中差異表達(dá)基因（DEGs）熱圖。
(E) 三個(gè)組中上調(diào)DEGs的維恩圖。
(F-H) 對重疊上調(diào)DEGs的GO富集分析。根據(jù)細(xì)胞組分（CC）(F)、生物過程（BP）(G) 和分子功能（MF）(H) 對預(yù)測基因進(jìn)行GO分析。
(I) 對DEGs的KEGG通路分析。總結(jié)了前20條通路。
（4）DMR與全基因組基因表達(dá)的相關(guān)性分析
圖4：DMRs與全基因組基因表達(dá)之間的相關(guān)性分析。
（A）甲基化組和轉(zhuǎn)錄組綜合分析的研究設(shè)計(jì)圖。（B） 低甲基化 DMR 上調(diào) DEG 的 VENN 分析。
（C -D） 不同 NOD 組中啟動子低甲基化上調(diào)基因的 GO 和 KEGG 分析。
（5）與SS相關(guān)干眼癥相關(guān)關(guān)鍵DNA甲基化調(diào)控基因的鑒定
圖5：鑒定與SS相關(guān)干眼癥相關(guān)的主要DNA甲基化調(diào)控基因。
(A) 關(guān)鍵基因篩選流程圖。(B) 與SS相關(guān)干眼癥相關(guān)的候選功能基因的啟動子甲基化水平和表達(dá)水平熱圖。
(C) qRT-PCR驗(yàn)證淚腺中候選基因的mRNA表達(dá)水平。每組n=3。
(D) 候選基因表達(dá)水平與淚腺中淋巴細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性分析。
(E) 4、8、12和16周齡組淚腺中DAPI和CD4+的免疫熒光標(biāo)記。
(F) 候選基因表達(dá)水平與淚腺中CD4+細(xì)胞浸潤程度之間的相關(guān)性分析。
(G) 與對照組4周齡小鼠相比，SS相關(guān)干眼癥NOD小鼠Icosl（n=3）、Irf4（n=3）、Vav1（n=3）和Itgal（n=3）基因的MSP表征。
易小結(jié)
本研究通過RRBS+RNA-seq的綜合分析揭示了在NOD小鼠SS相關(guān)干眼癥的發(fā)展過程中，淚腺的基因組DNA甲基化水平增加。NOD小鼠淚腺中上調(diào)的Itgal、Icosl、Vav1和Irf4基因與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，可能在SS相關(guān)干眼癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，Itgal和Irf4啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平降低，可能是SS相關(guān)干眼癥中Itgal和Irf4上調(diào)的原因。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助進(jìn)一步理解SS相關(guān)干眼癥的病因，并為SS相關(guān)干眼癥的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Sun M, Wei Y, Zhang C, Nian H, Du B, Wei R. Integrated DNA Methylation and Transcriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential Genes Implicated in the Development of Sjögren's Syndrome-Related Dry Eye. J Inflamm Res. 2023;16:5697-5714. pii: 440263. doi: 10.2147/JIR.S440263. PubMed PMID: 38050559.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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