Western Blot實驗中常見問題的原因及解決方案
Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的實驗。在WB 實驗中常會出現各種問題，而拖慢實驗速度，使實驗達不到理想的效果。今天百螢跟各位同學一起分享下 WB 實驗中各種問題及問題建議。
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| 常見問題 | 可能原因 | 建議 |
| 電泳條帶成笑臉狀 | 膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統溫度偏高 | 減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳 |
| 電泳條帶成皺眉狀 | 可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全 | 調整裝置 |
| 拖尾 | 樣品溶解不好 | 樣品充分溶解混勻后上樣 |
| 紋理(縱向條紋) | 樣品中含有不溶性顆粒 | 樣品充分攪拌混勻 |
| 條帶偏斜 | 電極不平衡或者加樣位置偏斜 | 調整電極和加樣 |
| 條帶兩邊擴散 | 加樣量過多 | 適當減少上樣量 |
| Marker 變黑色 | 抗體和 Marker 蛋白反應 | 在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣 |
| 背景高 | 膜封閉不夠 | 延長封閉時間，選擇適宜的抗體稀釋度 |
| 一抗稀釋度不適宜 | 對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度 | |
| 一抗孵育的溫度偏高 | 建議 4℃ 結合過夜 | |
| 二抗濃度度過高 | 降低二抗濃度 | |
| 二抗的非特異性背景 | 增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈） | |
| 二抗孵育時間過久 | 減少二抗孵育時間 | |
| 選擇膜的問題 | 硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低 | |
| 膜在實驗過程中干過 | 實驗過程中要注意保持膜的濕潤 | |
| 檢測時曝光時間過長 | 注意曝光時間的縮短 | |
| 洗膜不充分 | 增加洗膜的時間和次數 | |
| 抗體和封閉蛋白有交叉反應 | 檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應 | |
| 雜帶較多 | 目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點，糖基化位點，乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶 | 查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小 |
| 目的蛋白有其他剪切本 | 查閱文獻或生物信息學分析可能性 | |
| 樣品處理過程中目的蛋白發生降解 | 裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進行 | |
| 上樣量過高，太敏感 | 適當減少上樣量 | |
| 一抗不純 | 純化抗體 | |
| 一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體 | |
| 二抗的非特異性結合 | 增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈） | |
| 一抗或二抗濃度偏高 | 降低抗體濃度 | |
| 細胞傳代較多，導致蛋白變異 | 使用原代或傳代少的細胞作對照 | |
| 蛋白條帶位置 （大小）不對 |
二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質變性過程及強度 |
| 翻譯后剪切 | 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執行功能時需要進行剪切成活化的形式 | |
| 相對電荷 | 氨基酸電荷的組成 | |
| 蛋白修飾 | 比如糖基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加 | |
| 膠濃度 | 不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差 | |
| 無蛋白條帶 | 抗體孵育不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
| 標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 | |
| 試劑之間不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 | |
| 一抗失效 | 選擇在有效期內抗體，幷選擇現配現用的工作液 | |
| HRP 抑制劑 | 所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉 | |
| 抗體不能識別測試種屬的相關蛋白 | 購買抗體前應認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白 | |
| 二抗與一抗不匹配 | 選擇針對一抗來源種屬的抗體 | |
| 蛋白條帶信號弱 | 抗體孵育不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶活性降低 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
| 洗膜過度 | 洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20 | |
| 標本中靶蛋白含量太低 | 增加樣本上樣量 | |
| 抗體活性降低 | 選擇有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 | |
| 蛋白轉移不充分 | 可以用麗春紅染膜幷結合染膠（考馬斯藍）后確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度，適當調整轉膜的時間和電流 | |
| 封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型 | |
| 曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
| HRP 抑制劑 | 所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉 | |
| 背景有黑色斑點 | 抗體與封閉試劑反應 | 使用前過濾封閉試劑 |
| HRP 偶聯二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
| 暗背景上白色帶 | HRP 含量過高 | 降低酶聯二抗的濃度 |
| 背景有不均勻的白色斑點 | 轉膜過程中有氣泡存在 | 仔細檢測，避免存在氣泡 |
| 抗體分布不均勻 | 孵育抗體時使用搖床 |
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