蛋白質印跡(WB)實驗操作步驟詳解
WB，蛋白質印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
實驗步驟：
一、蛋白質樣品制備：
原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。
1.培養細胞或藥物處理。
2.棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。
3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。
4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5.煮沸樣品5min。
6.離心12000g，5min，取上清。
二、SDS-PAGE電泳
一、清洗玻璃板；
二、灌膠與上樣：
1. 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。
2. 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
3. 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
4. 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。
7. 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當溴酚藍遷移至離底部1cm時，停止電泳。
三、轉膜
1. 將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10min。 注意：若檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。
2. 依據膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。
3. 裝配轉移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負極面(黑色面)。
4. 將轉移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色面)，加轉移緩沖液， 插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。
5. 轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。
四、封閉與雜交
1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。
2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。
3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。
4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。
5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。
7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
8.15ml TBS洗1次。
六、顯色
將 A、B 發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。
實驗步驟：
一、蛋白質樣品制備：
原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。
1.培養細胞或藥物處理。
2.棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。
3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。
4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5.煮沸樣品5min。
6.離心12000g，5min，取上清。
二、SDS-PAGE電泳
一、清洗玻璃板；
二、灌膠與上樣：
1. 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。
2. 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
3. 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
4. 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。
7. 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當溴酚藍遷移至離底部1cm時，停止電泳。
三、轉膜
1. 將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10min。 注意：若檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。
2. 依據膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。
3. 裝配轉移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負極面(黑色面)。
4. 將轉移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色面)，加轉移緩沖液， 插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。
5. 轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。
四、封閉與雜交
1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。
2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。
3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。
4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。
5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。
7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。
8.15ml TBS洗1次。
六、顯色
將 A、B 發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。
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