無論用戶使用的是可溶性蛋白還是膜蛋白，都需要篩選和優化眾多結晶條件，以找到合適的結晶條件。在脂質立方相 (LCP) 中成功結晶的主要因素之一是蛋白質在脂質雙層內擴散的能力。蛋白質的擴散速率受蛋白質聚集、LCP 的結構特性和化學環境的影響。擴散速率可以通過光漂白后的熒光恢復 (FRAP) 來確定，它測量標記蛋白的熒光強度在經過光漂白的 LCP 液滴中的一小塊區域內重新恢復所需的時間量（圖1）。用戶可以繪制和分析歸一化熒光強度與時間的曲線，以量化兩個與蛋白擴散相關的特性：遷移率（強度曲線漸近接近的值）和擴散速率（與曲線起點處的斜率成比例） 。

圖 1. 1) 以預漂白樣品圖像作為基線熒光強度；2) 樣品通過一個小的（~15 微米直徑）激光光斑進行光漂白。3) 隨著漂白分子向外擴散和新分子向內擴散，監測該漂白點內的熒光強度。

自動化 LCP-FRAP 儀器最初由斯克里普斯研究所開發，現在由 FORMULATRIX® 生產，極大地加快了LCP 板的篩選過程。用戶使用 FRAP 進行篩選，無需等待數天到數周來確定晶體是否已形成， FRAP 給予了使用者即時觀察，以此判斷條件是否最適合結晶，同時排除那些由于擴散速率不高而不會形成結晶的條件。雖然整個 FRAP 過程仍然相對緩慢，每個蛋白液滴需要花 15-20 分鐘才能完成，但這樣需要的蛋白質量相對較少。一種能夠避免每個 LCP-FRAP 樣本的數據采集時間過長的方法便是僅收集終態熒光強度。

FRAP 系統通過使用這種三點數據收集方法（圖 2），可以依次漂白所有 96 個孔，然后返回收集熒光恢復圖像。雖然這種方法只能恢復樣本的遷移率，但研究人員仍然能夠僅依靠遷移率分析來識別潛在的結晶樣本。

圖 2. 高通量 FRAP 方法僅用于收集最終狀態熒光強度以確定樣本遷移率結果。

利用圖 3 所示的工作流程，FORMULATRIX 的 RockImager-FRAP 可以在 50 分鐘內完成 96 孔 FRAP 數據采集。

圖 3. 高通量 LCP-FRAP 數據采集流程圖

整塊結晶板的 FRAP 遷移率數據可以分組到具有顏色編碼背景的畫布視圖中，以便用戶快速識別結晶孔（圖 4）。然后，研究人員可以與軟件進行交互，將孔標記為結晶或非結晶。在大多數情況下，僅遷移恢復數據就足以讓研究人員識別潛在的結晶生成條件。盡管如此，人們可能仍希望生成完整的恢復曲線來檢查曲線形狀并確定擴散速率。為避免通過完全恢復運行所有 96 個樣本，此過程僅適用于用戶在三點高通量 FRAP 分析期間指定的那些潛在結晶生成孔。

圖 4. 收集的 FRAP 遷移率數據顯示在畫布視圖中，顏色編碼用于快速識別有無結晶生成可能。

可以繪制完整的強度恢復曲線并用貝塞爾函數擬合以得出擴散速率和恢復時間。在大多數情況下，單個 Bessel 函數足以實現低殘差擬合結果。在其余的大多數情況下，兩種不同類型的分子同時擴散。這通常是因為蛋白質沒有被充分純化，而脂質和蛋白質分子都被熒光染料標記。較小分子量的脂質比大蛋白質分子擴散得快得多。在這種情況下，必須使用雙分量 Bessel 函數擬合來準確模擬兩種不同的擴散速率。