影響PCR反應(yīng)的七個基本條件分析
基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。影響PCR反應(yīng)的基本條件分析如下：
一、模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴(kuò)增，處理不當(dāng)或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴(kuò)增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
二、引物
PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當(dāng)數(shù)量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和信號強(qiáng)度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20℃至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20℃保存。
三、緩沖液
PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產(chǎn)量。
四、Mg2+
Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。
五、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）
四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導(dǎo)致聚合將其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”），因此應(yīng)當(dāng)避免。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。
六、耐熱DNA聚合酶
PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強(qiáng)度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實驗失敗的常見原因。
七、溫度循環(huán)參數(shù)
1．變性溫度與時間
PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第一個循環(huán)變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時間太長會增加非特異的復(fù)性。
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會影響其產(chǎn)量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時間要長些。
4．循環(huán)數(shù)
循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。
一、模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴(kuò)增，處理不當(dāng)或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴(kuò)增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當(dāng)數(shù)量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和信號強(qiáng)度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20℃至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20℃保存。
PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴(kuò)增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進(jìn)引物的錯誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量降低。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發(fā)現(xiàn)，最適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此濃度。
三、緩沖液
PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產(chǎn)量。
反應(yīng)混合液中50mmol/L以內(nèi)的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的穩(wěn)定，反應(yīng)中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴(kuò)增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護(hù)劑對PCR反應(yīng)是有利的。
四、Mg2+
Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。
五、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）
四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導(dǎo)致聚合將其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”），因此應(yīng)當(dāng)避免。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。
六、耐熱DNA聚合酶
PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強(qiáng)度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實驗失敗的常見原因。
七、溫度循環(huán)參數(shù)
1．變性溫度與時間
PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第一個循環(huán)變性最重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。
2．復(fù)性溫度與時間
變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時間太長會增加非特異的復(fù)性。
3．延伸溫度與時間
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會影響其產(chǎn)量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時間要長些。
4．循環(huán)數(shù)
循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。
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