文獻信息

近日，北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院醫(yī)學同位素研究中心、北京大學第一醫(yī)院核醫(yī)學科等團隊的研究成果Noninvasive interrogation of CD8+T cell effector function for monitoring tumor early responses to immunotherapy（CD8+T細胞效應因子功能的無創(chuàng)性探究監(jiān)測腫瘤對免疫治療的早期反應）在學術期刊The Journal of Clinical Investigation（影響因子19.456）發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為劉昭飛教授、李囡主任醫(yī)師、楊興研究員。第一作者為周昊毅、王琰璞。

文獻信息

準確識別對免疫治療有反應的患者在臨床上仍然具有挑戰(zhàn)性。一種非侵入性的方法，可以縱向捕獲有關免疫細胞功能的信息，并協(xié)助早期評估腫瘤反應是非常理想的精確免疫治療。在這里，作者展示了正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像使用顆粒酶B靶向放射示蹤劑，命名為⁶⁸Ga-grazytracer，可以無創(chuàng)和有效地預測多種腫瘤模型中對免疫檢查點抑制劑和過繼T細胞轉(zhuǎn)移治療的反應。⁶⁸Ga-grazytracer從多種非醛類肽基示蹤劑中篩選而來，具有良好的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性和對效應CD8+T細胞在免疫反應中分泌顆粒酶B的靶向性。⁶⁸Ga-grazytracer比¹⁸F-FDG更敏感地區(qū)分有反應者和無反應者，從而在不同免疫原性的小鼠模型中，通過免疫檢查點封鎖治療區(qū)分腫瘤的假進展和真進展。在一項有5名患者參與的初步臨床試驗中，注射⁶⁸Ga-grazytracer后未觀察到不良事件，接受免疫治療的癌癥患者的臨床反應與⁶⁸Ga-grazytracer PET結果良好相關。這些結果強調(diào)了⁶⁸Ga-grazytracer PET在顆粒酶B分泌相關免疫療法的臨床應用方面的潛力，通過支持早期反應評估和以無創(chuàng)傷和縱向的方式精確的患者分層。

實驗方法

使用Super Nova PET/CT掃描儀(平生醫(yī)療科技有限公司)對小動物PET進行掃描和圖像分析。MC38, LLC, 4T1或B16OVA荷瘤小鼠在異氟烷麻醉下給予5.55 MBq ⁶⁸Ga標記的放射性示蹤劑或¹⁸F-FDG。為了¹⁸F-FDG成像，MC38和4T1腫瘤小鼠在注射¹⁸F-FDG前禁食6小時。在注射后的指定時間(如0.5、1和2小時)，進行10分鐘靜態(tài)PET掃描。分析PET圖像，并按照前面所述計算感興趣區(qū)域(ROI)導出的每克組織注射劑量百分比(%ID/g)值對于假性進展和真性進展的腫瘤模型，MC38和4T1荷瘤小鼠腹腔注射200 μg抗PD-1(克隆RMP1-14)+ 200 μg抗CTLA-4抗體(克隆9D9;在第0、3和6天使用)。在第0天(基線)和第6天，小鼠在注射0.5或1小時后接受⁶⁸Ga-grazytracer或¹⁸F-FDG的小動物PET成像。

實驗結果

⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1預處理的MC38荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。⁶⁸Ga-grazytracer在注射0.5 h后腫瘤攝取最高，隨著時間的推移⁶⁸Ga-grazytracer腫瘤攝取下降(圖2E)。由于血液中的放射性示蹤劑被迅速清除，腫瘤與血液的比值隨著時間的推移而增加。注射后1小時腫瘤-肌肉比最高(圖2F)。體內(nèi)生物分布證實了⁶⁸Ga-grazytracer PET在體內(nèi)的結果(圖S6)。為了進一步研究⁶⁸Ga-grazytracer PET的腫瘤攝取值是否確實能反映顆粒酶B在體內(nèi)的水平，作者對一些荷瘤小鼠進行了⁶⁸Ga-grazytracer PET成像。老鼠PET掃描后立即實施安樂死,granzyme B表達測量腫瘤(圖2GH)。

圖2 ⁶⁸Ga-grazytracer的體內(nèi)外表征。(A)免疫治療后效應T細胞活化和顆粒酶B (GrzmB)分泌示意圖。(B) ⁶⁸Ga-grazytracer的化學結構。(C) ⁶⁸Ga-grazytracer與小鼠或人顆粒酶B結合的特異性(n = 5)。(D)注射64Cu-grazytracer 0.5 h后，MC38荷瘤小鼠15 μm厚的腫瘤連續(xù)切片的放射自顯影(中)和顆粒酶B免疫熒光染色(兩張)。這三個連續(xù)剖面的覆蓋區(qū)域用紅色虛線表示。規(guī)模:1毫米。數(shù)據(jù)是三個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。(E)注射后0.5、1和2小時，⁶⁸Ga-grazytracer在抗pd -1處理的小鼠體內(nèi)的代表性PET圖像。(F)計算⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤-血液和腫瘤-肌肉比值(n = 5)。(G) ⁶⁸Ga-grazytracer在MC38載瘤小鼠中的小動物PET圖像和相應的腫瘤攝取值(16只小鼠接受PET成像，2只因尾靜脈注射失敗而被排除)。(H)從MC38荷瘤小鼠身上提取的MC38腫瘤顆粒酶B的Western blotting(圖G)。通道在同一凝膠上運行，但不連續(xù)。(I) PET成像定量⁶⁸Ga-grazytracer腫瘤攝取與體外western blotting測定顆粒酶B/β-微管蛋白比值的相關性(Pearson相關分析r = 0.7168)。(J) PET成像定量的⁶⁸Gagrazytracer腫瘤攝取與ELISA測定的體外顆粒酶B水平之間的相關性(Pearson相關分析r = 0.7337)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。**，P <0.01未配對Student t檢驗(C)。

隨后，作者通過靶向效應T細胞在免疫反應中釋放的顆粒酶B，測試⁶⁸Ga-grazytracer PET是否可以用于預測動物模型中對ICI的早期腫瘤反應。14只MC38荷瘤小鼠在第0、3、6天使用抗PD-1抗體處理，第9天使用⁶⁸Ga-grazytracer PET(圖3A)。在治療組觀察到⁶⁸Ga-grazytracer的可變腫瘤攝取(圖3B)。抗PD-1治療組小鼠按68Ga-grazytracer腫瘤攝取值分為2組(截止值為1.45% ID/g;⁶⁸Ga-grazytracer在對照組中腫瘤攝取值最高):腫瘤攝取≥1.45% ID/g(高攝取組;平均腫瘤攝取= 2.23±0.33;腫瘤攝取范圍為1.93 ~ 2.84)，腫瘤攝取< 1.45% ID/g者(低攝取組;平均腫瘤攝取= 1.18±0.19;腫瘤攝取范圍:11 0.93 ~ 1.44;圖3 b)。監(jiān)測載藥對照組和抗PD-1治療組的腫瘤生長曲線(圖3C)。第9天，高攝取組⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取量顯著高于對照組和低攝取組(P <0.0001;圖3 d)。

圖3 ⁶⁸Ga-grazytracer的小動物PET成像預測MC38荷瘤小鼠對抗PD-1治療的腫瘤反應。(A)抗PD-1 (αPD-1)治療時間軸和MC38荷瘤小鼠PET成像。(B)注射后0.5h ⁶⁸Ga-grazytracer在PBS(對照)或抗PD-1處理的MC38荷瘤小鼠體內(nèi)的代表性PET圖像，腫瘤攝取高低(截止值為1.45% ID/g)。白色箭頭表示腫瘤。(C)對照組或高、低腫瘤攝取治療組的MC38荷瘤小鼠的個體腫瘤體積。(D)在第9天注射后0.5 h，每組MC38荷瘤小鼠對⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取定量(n = 7/組)。(E) MC38荷瘤小鼠第9天和第16天的腫瘤體積(n = 7/組)。(F)流式細胞術分析描繪了CD8+ T細胞在CD45+細胞，IFN-γ+或顆粒酶B+ CD8+ T細胞中的比例，以及顆粒酶B水平從小鼠身上提取的治療后(n = 5-6 /組)。(G, H) MC38荷瘤小鼠在指定處理后的腫瘤生長曲線(G)和體重曲線(H) (n = 6-8 /組)。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;* * *, P < 0.001;****，P <0.0001通過單向方差分析和事后Tukey檢驗(D, E, F)和雙向方差分析(G)。

作者在第0天和第6天對兩種腫瘤模型進行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的PET成像。由于腫瘤進展(圖4B, C)和糖代謝增加，MC38 (P <0.05)和13 4T1腫瘤(P <0.01)模型中¹⁸F-FDG的腫瘤攝取從第0天到第6天顯著增加(圖4F-I)。相反，在假性進展的MC38腫瘤模型中，⁶⁸Ga-grazytracer的腫瘤攝取從第0天到第6天顯著增加(P <0.01，圖4F, G)。然而，在4T1小鼠荷瘤真進展模型中沒有觀察到⁶⁸Ga-grazytracer的顯著攝取(圖4H, I)。這些結果表明，⁶⁸Ga-grazytracer PET在ICI治療第6天檢測到MC38腫瘤而不是4T1腫瘤的高顆粒酶B分泌，從而預測早期治療階段的腫瘤反應。

圖4 ⁶⁸Ga-grazytracer PET在抗pd-1 (αPD-1)和抗ctla -4 (αCTLA-4)治療的假進展和真進展小鼠模型中成像。(A) MC38或4T1腫瘤模型的免疫治療和PET成像時間軸。(B, C)治療后MC38荷瘤小鼠(假性進展)(B)和4T1荷瘤小鼠(真進展)的個體腫瘤生長曲線(C)。(D, E) MC38 (D)和4T1 (E)荷瘤小鼠治療后體重。(F, G)第0和6天假進展MC38荷瘤小鼠¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(F)和定量腫瘤攝取(G) (n = 8-9 /組)。(H, I)真實進展4T1荷瘤小鼠在第0天和第6天(n = 8-9 /組)18F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(H)和定量腫瘤攝取(I)。(J)第0天和第6天收獲的MC38或4T1腫瘤組織中顆粒酶B的代表性免疫熒光染色。規(guī)模,1毫米。數(shù)據(jù)是三個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。*, P < 0.05;**， P <0.01 by雙尾配對Student t檢驗(G, I)。

anti-PD-1 + anti-CTLA-4組在添加或不添加FTY720時分別進行¹⁸F-FDG和⁶⁸Ga-grazytracer PET顯像。在FTY720處理組和未處理組，¹⁸F-FDG在0 - 6天顯示相似的成像模式(圖5C, D)。相反，⁶⁸Ga-grazytracer在抗PD-1 +抗CTLA -4治療后0 - 6天內(nèi)腫瘤攝取增加。同時，antiPD-1 + anti-CTLA-4和FTY720處理后0 - 6天無顯著差異(圖5E, F)。

圖5 ⁶⁸Ga-grazytracer在免疫細胞浸潤抑制或不抑制小鼠模型中的PET成像。(A) MC38荷瘤小鼠PET成像、抗PD -1 (αPD-1) + 抗CTLA-4 (αCTLA-4)聯(lián)合免疫治療和FTY720治療的時間軸。(B) MC38荷瘤小鼠在指定治療后的腫瘤生長曲線:對照(PBS)、FTY720、αPD-1 + αCTLA-4和αPD-1 + αCTLA-4 + FTY720 (n = 6 - 9/組)(C, D)在αPD-1 + αCTLA-4治療的MC38荷瘤小鼠(n = 8-9 /組)0和6天18F-FDG的代表性PET圖像(C)和腫瘤攝取定量(D)。(E, F) ⁶⁸Ga-grazytracer在αPD-1+αCTLA-4處理的MC38載瘤小鼠(FTY720處理或不處理)第0天和第6天的代表性PET圖像(E)和定量腫瘤攝取(F) (n = 8-9 /組)。(G)流式細胞術分析顯示，經(jīng)過指示性治療的小鼠腫瘤中NK1.1+細胞、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞在CD45+細胞中的比例(n = 5/組)。PET圖像中白色箭頭表示腫瘤。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;****， P <0.0001通過雙向方差分析(B)，雙尾配對Student t檢驗(D, F)，和雙尾不配對Student t檢驗(G)。

與第8天相比，對照組第12天腫瘤對⁶⁸Ga-grazytracer的攝取相對沒有變化(圖6D, E)。同時，經(jīng)過WT T細胞過繼轉(zhuǎn)移的組，部分腫瘤在第12天對⁶⁸Ga-grazytracer的攝取增加;然而，與基線值(第8天;圖6 e)。

圖6采用過繼T細胞轉(zhuǎn)移(ACT)治療的小鼠⁶⁸Ga-grazytracer的PET成像。(A) B16 -卵白蛋白(OVA)荷瘤小鼠的PET成像和ACT示意圖。(B, C) B16-OVA荷瘤小鼠在指示性治療后的腫瘤生長曲線(B)和體重(C):對照(PBS)、野生型(WT) T細胞和OT-I T細胞(n = 5-7 /組)。(D, E) B16-OVA荷瘤小鼠經(jīng)PBS或WT或OT-I小鼠的T細胞處理后第8天和第12天⁶⁸Ga-grazytracer的代表性PET圖像(D)和腫瘤攝取定量(E) (n = 5-6 /組)。白色箭頭表示腫瘤。(F)流式細胞術分析描繪了CD8+ T細胞在CD45+細胞和顆粒酶B+ CD8+ T細胞的比例，從小鼠身上提取的腫瘤治療12天后(n = 5/組)。(G) ⁶⁸Ga-grazytracer在小鼠治療后第12天的腫瘤攝取定量(n = 5-6 /組)。所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。*, P < 0.05;* *, P < 0.01;***， P <0.001的雙向方差分析(B)，雙尾配對Student t檢驗(E)，和單向方差分析與事后的Tukey檢驗(F, G)。

文獻結論

綜上所述，作者設計了一種PET示蹤劑⁶⁸Ga-grazytracer，專門靶向顆粒酶B，并監(jiān)測多種免疫療法在不同腫瘤小鼠模型中的療效。⁶⁸Ga-grazytracer在識別ICIs治療的動物模型中腫瘤假進展方面優(yōu)于18F-FDG。一項初步的臨床研究進一步證實了⁶⁸Ga-grazytracer PET在監(jiān)測免疫治療中的作用，為未來更大隊列的臨床研究提供了理論可行性。⁶⁸Ga-grazytracer的簡單合成過程使得試劑盒配方的廣泛臨床應用成為可能，⁶⁸Ga-grazytracer PET可能提供一種通用的免疫監(jiān)測方法，能夠通過腫瘤反應預測和患者分層指導精確的腫瘤免疫治療。此外，由于顆粒酶B的分泌廣泛存在于各種免疫相關疾病，⁶⁸Ga-grazytracer PET可能被證明是有效的PET腫瘤成像。

使用設備

Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）