單細(xì)胞測序聯(lián)合多重?zé)晒饷庖呓M化助力肺癌腦轉(zhuǎn)移的免疫療法探索
腦惡性腫瘤又常稱為腦癌，分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類：原發(fā)性腦惡性腫瘤以腦膠質(zhì)瘤最多，是一種起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤；繼發(fā)性腫瘤主要是指其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)形成的腦轉(zhuǎn)移性腫瘤，其發(fā)病率約是原發(fā)腫瘤的10倍，肺癌就是常見的原發(fā)癌種之一。
2022年11月6日，復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院金偉教授和曹依群教授團(tuán)隊在Clin. Transl. Med（IF=8.554）上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases”的文章，通過scRNA-seq技術(shù)（BD Rhapsody system）聯(lián)合多重?zé)晒饷庖呓M化（abs50015，Absin），解析了GM和LC細(xì)胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了一組具有特異性分子標(biāo)記的干細(xì)胞樣細(xì)胞，對于肺癌腦轉(zhuǎn)移的免疫療法有重要的指導(dǎo)性意義。
取樣、測序、分析和組織原位驗證的全流程
研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一部分增殖巨噬細(xì)胞簇與不良預(yù)后相關(guān)。氣泡圖顯示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)駐留小膠質(zhì)細(xì)胞（CNS）以及單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（MDMs）表達(dá)TAMs相關(guān)基因的情況，其中CD163在MDMs高表達(dá)，而在CNS顯著低表達(dá)。通過小提琴圖分析可得，TOP2A基因在增殖巨噬細(xì)胞的分布（后兩列），極端值和中位值都比其他細(xì)胞更好。后續(xù)研究團(tuán)隊通過對TOP2A和CD163進(jìn)行多重免疫熒光染色在組織蛋白層面驗證了細(xì)胞群。
癌癥干細(xì)胞（CSCs）是會導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移和化療或放療耐藥性的細(xì)胞亞群。研究團(tuán)隊通過拷貝數(shù)變異分析鑒定了惡性細(xì)胞并劃分為10個惡性上皮細(xì)胞亞群，基于CytoTRACE分析和擬時序分析顯示，惡性上皮細(xì)胞亞群中Mep_C3和C8分化程度較低，可能包含CSCs。為了證實Mep_C3和_C8在LC組織中的存在，團(tuán)隊通過多重免疫組化檢測了主要標(biāo)記物的表達(dá)（EPCAM/DKK1/TRIM29），發(fā)現(xiàn)DKK1和TRIM29在這些細(xì)胞中特異性富集。
總的來說，團(tuán)隊的研究結(jié)果為小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、ECs和T細(xì)胞的特征提供了特別的見解，還發(fā)現(xiàn)了癌癥干細(xì)胞的一個子集，這將加深對大腦腫瘤微環(huán)境的理解，從而為精準(zhǔn)醫(yī)療的患者管理提供一些改善思路。
多色小知識
多色即多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC），主要原理來自TSA技術(shù)，TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。
TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團(tuán)，結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。
簡單來說，用這種方法做多重?zé)晒馊旧抢枚股蠋в械腍RP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后進(jìn)行微波處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。
TSA多重?zé)晒饷庖呓M化染色示意圖
