胰腺四周布滿了十二指腸和膽總管等高度血管化的器官。胰腺癌經(jīng)常侵襲并轉(zhuǎn)移至周?chē)�的器官以及更遠(yuǎn)位置的器官，例如肝臟、腹膜、肺、大腦、腎臟和骨骼。傳統(tǒng)的化療加放療或疾病晚期的化療加靶向藥物治療可以延長(zhǎng)患者的生存期。但是，即使腫瘤局限的患者中，也僅有40%左右的患者能夠達(dá)到5年的生存期。這就說(shuō)明亟需為所有胰腺癌患者改善傳統(tǒng)和免疫療法。腫瘤細(xì)胞可以逃避治療并繼續(xù)生長(zhǎng)。另外，腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞也是促使持續(xù)性腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵支持土壤。了解腫瘤微環(huán)境中的所有細(xì)胞的免疫狀態(tài)對(duì)于理解腫瘤轉(zhuǎn)移和改進(jìn)癌癥治療方法至關(guān)重要，尤其是免疫療法。

在本研究中，使用了數(shù)十個(gè)生物標(biāo)志物研究胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）組織中的腫瘤異質(zhì)性。使用Cell DIVE^™超多標(biāo)組織成像整體分析解決方案，數(shù)十個(gè)生物標(biāo)志物可表征腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞活性和細(xì)胞間的空間位置關(guān)系。我們檢查了腫瘤、基質(zhì)各成分和免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。所使用的生物標(biāo)志物組合可用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)的基質(zhì)成分和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、炎癥、缺氧、代謝和免疫反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)這些異質(zhì)性作用經(jīng)常都是相互影響的。例如，腫瘤內(nèi)一些分區(qū)會(huì)適應(yīng)缺氧條件并因此導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞增殖失控。另外，這些缺氧區(qū)域缺乏免疫細(xì)胞。超多標(biāo)組織全玻片成像支持對(duì)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行空間分辨組織分析，包括對(duì)細(xì)胞間相互作用和組織免疫狀態(tài)的研究獲得全新的認(rèn)識(shí)。

方法和材料
在本研究中，使用商業(yè)來(lái)源（Pantomics）獲得的胰腺導(dǎo)管腺癌的FFPE樣本。抗體經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證過(guò)程（Gerdes等，2013）以確保抗體的結(jié)合性能類(lèi)似于組織一抗/二抗間接標(biāo)記。本研究中使用了不同供應(yīng)商提供的三十個(gè)生物標(biāo)志物，均作為商業(yè)偶聯(lián)抗體或者自行偶聯(lián)。使用Leica Bond（徠卡生物系統(tǒng)）對(duì)玻片進(jìn)行循環(huán)染色；在Cell DIVE上使用四通道+DAPI成像玻片，并對(duì)圖像進(jìn)行自動(dòng)化自發(fā)熒光移除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)利軟件拼接圖像進(jìn)行導(dǎo)入、融合、可視化和分析。該軟件將于2023年上半年上市。

結(jié)果
使用Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案，用30個(gè)生物標(biāo)志物循環(huán)染色了一個(gè)PDAC FFPE切片，確定侵襲性腫瘤細(xì)胞的空間狀態(tài)。本研究中使用的標(biāo)志物在空間上確定了腫瘤內(nèi)的代謝和缺氧、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫細(xì)胞狀態(tài)（圖1 A）。在使用全套30個(gè)生物標(biāo)志物進(jìn)行細(xì)胞分割后，一小部分生物標(biāo)志物被用來(lái)對(duì)腫瘤的異質(zhì)區(qū)域進(jìn)行分類(lèi)和空間表征（圖1B）。具體來(lái)說(shuō)，缺氧標(biāo)志物Glut1和兩個(gè)PanCK生物標(biāo)志物區(qū)分出了葡萄糖攝取量增加的癌細(xì)胞，這是一個(gè)癌癥標(biāo)志。通過(guò)這種方式，將腫瘤中侵襲性較強(qiáng)區(qū)域的細(xì)胞類(lèi)型與侵襲性較弱區(qū)域或正常組織的細(xì)胞分開(kāi)分析，可以減少異質(zhì)性。量化各區(qū)域的免疫貢獻(xiàn)，常氧腫瘤和正常胰腺與缺氧腫瘤區(qū)域相比，缺氧區(qū)域的淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞總體減少，盡管所有區(qū)域的細(xì)胞總數(shù)接近（圖1D）并顯示了代表性的表型圖像（圖1D底部）。

通過(guò)聚類(lèi)分析無(wú)偏差性的確定了細(xì)胞亞群。聚類(lèi)分析和降維顯示，與其他區(qū)域相比，缺氧腫瘤區(qū)域的該細(xì)胞群體較少（圖2）。與基于表型的免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)類(lèi)似，在缺氧腫瘤區(qū)域存在極少的淋巴細(xì)胞（圖2C聚類(lèi)和UMAP）。有趣的是，幾個(gè)聚類(lèi)顯示了具有明顯膠原沉積的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）群體（圖2C；橙色方框）。此外，對(duì)空間聚類(lèi)關(guān)系的分析清楚地確定了與CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）在同一空間鄰域中常見(jiàn)的細(xì)胞類(lèi)型（圖2C；鄰域圖）。例如，聚類(lèi)5（SMA+基質(zhì)集群）和聚類(lèi)8（免疫細(xì)胞；CD45+，膠原蛋白+）是聚類(lèi)16（SMA+膠原蛋白+；ClAP1+）的共同鄰居，表明炎癥和腫瘤導(dǎo)致的結(jié)締組織增生通常與PDAC患者的不良生存結(jié)果有關(guān)²。

結(jié)論
我們的研究展示了使用Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案對(duì)單個(gè)PDAC切片進(jìn)行30種生物標(biāo)志物的循環(huán)染色和成像。在腫瘤微環(huán)境中，結(jié)合使用超多標(biāo)組織成像和單細(xì)胞分析可形成強(qiáng)大的功能，能夠在腫瘤的侵襲性區(qū)域詳細(xì)檢測(cè)單細(xì)胞生物標(biāo)志物的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)、和癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAF）的貢獻(xiàn)得到了空間上的確定。

未來(lái)的工作將會(huì)進(jìn)一步確定PDAC中的細(xì)胞外基質(zhì)、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和炎癥成分。例如，除了C0L1A1之外，還可以探索其他膠原蛋白、纖連蛋白和SPARC，以及參與CAF浸潤(rùn)和炎癥的其他因素。

重要的是，Cell DIVE超多標(biāo)組織成像整體分析解決方案可以保留組織，生物標(biāo)志物的表達(dá)可以繼續(xù)在同一組織切片上進(jìn)行探索，并與研究中所有先前染色的生物標(biāo)志物重疊。表征腫瘤侵襲性區(qū)域的腫瘤微環(huán)境有助于闡明導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的新機(jī)制，并有助于發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)措施以提高未來(lái)治療PDAC的成功率。

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參考文獻(xiàn)：