貼壁細胞的培養

（１）貼壁細胞的復蘇

在準備進行細胞復蘇實驗時，應提前做好一下兩點準備：1.提前把超凈工作臺紫外滅菌30分鐘；2.提前把水浴鍋打開，使水溫保持在37攝氏度，并預熱復蘇細胞所用的培養基。上述準備工作完成以后就可以從液氮中取出保存的細胞，本著“慢凍速融”的原則，把細胞放進水溫３７攝氏度的水浴鍋中并不斷攪拌，使冷凍的細胞迅速融化，最大限度的保存細胞的活力，這個過程最好在兩分鐘之內完成。細胞解凍后放在離心機中以1000rpm的轉速離心3-5分鐘，離心結束小心棄去上清，并用提前預熱的完全培養基把細胞吹打混勻，再轉移至規格合適的培養器皿中，放入細胞培養箱培養即可。

（２）貼壁細胞的傳代

當我們在準備給貼壁細胞進行傳代的時候應該確認以下兩點：1.先把細胞從細胞培養箱中拿出，放在顯微鏡下觀察，確保細胞狀態良好，沒有污染；2.觀察細胞的匯合度達到70%-90%，細胞匯合度太低或者太高時對細胞進行傳代均不利于細胞生長。只有滿足這兩點基本條件，我們才能給細胞傳代。給細胞傳代時，首先我們棄去培養基，用pH=7.4的無菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2-3次，動作要輕柔防止細胞脫落。清洗完細胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞，消化過程中把細胞放在顯微鏡下觀察，直到細胞被消化成一個一個單獨的小圓球時加入完全培養基終止細胞消化，消化時間要把握好，消化時間太短細胞沒有消化下來，時間太長則會影響細胞活性。消化下來的細胞吹打混勻后以1:3-5的比例分裝到新的培養器皿中再加入足量的完全培養基繼續擴大培養。

（３）貼壁細胞的凍存

凍存細胞時，首先我們棄去培養基，用pH=7.4的無菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2-3次，動作要輕柔防止細胞脫落。清洗完細胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞，消化過程中把細胞放在顯微鏡下觀察，直到細胞被消化成一個一個單獨的小圓球時加入完全培養基終止細胞消化，消化下來的細胞吹打混勻后，按照以下比例混勻放入凍存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30％細胞懸液＋10%二甲基亞砜（DMSO）。特別值得注意的是，在凍存管上要標注清楚凍存的細胞名稱，細胞凍存的時間，凍存細胞的代數等信息。本著“慢凍速融”的原則，我們把寫好信息的凍存管放入慢凍盒中，放入負八十度冰箱冷藏十二個小時后再把細胞取出放入液氮中保存。

貼壁細胞的轉染

在準備做細胞轉染的前一天我們把細胞鋪進細胞培養皿中，加入完全培養基培養24小時，使得細胞匯合度達到百分之六十到百分之八十。在轉染前需要把完全培養基換成無雙抗的完全培養基，以排除雙抗對轉染效率的影響。根據轉染的細胞數不同選取適量的純培養基分別稀釋質粒和lipo3000，其中稀釋完的質粒中加入p3000充分混勻后再加入稀釋過的lipo3000中，把混合液輕柔的吹打混勻，室溫孵育20分鐘。孵育結束后把質粒-p3000-lipo3000混合液加入細胞培養皿中，然后再輕輕搖勻，放入細胞培養箱中繼續培養6個小時，再更換成帶有雙抗的完全培養基即可。