qPCR實驗中引物設計的詳細步驟介紹
如何成為qPCR高手?
今天要講的是引物篇。
“擎科小講堂”上周推出了qPCR高手養成記第一期干貨文章：耗材篇。大家呼聲很高，紛紛“催更”。本周我們將推出第二篇干貨內容：引物篇，圖文解析引物設計，助力實驗高效完成！
qPCR實驗中，引物設計是非常重要的一個環節，引物的合適與否與擴增效率是否達標、擴增產物是否特異、實驗結果是否可用等息息相關。
您是不是在qPCR引物設計中感到困惑：如何使引物特異性佳？有沒有什么一勞永逸的方法？
在設計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：
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引物盡量要跨內含子設計
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產物長度100-300 bp
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TM值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近
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引物末端是G或C
這么多的點要留意怎么辦？今天擎小科帶您一起五步搞定qPCR引物設計，讓qPCR引物設計成為你的絕殺技能。
第一步：查詢基因
通過NCBI查詢Homo GAS6的基因，這里要注意對比基因名稱、種屬，確保都要一致。
2.進入后，點擊如下表的“CDS”，棕色背景序列即為該基因的編碼序列。
2.在左上方輸入基因序列號或Fasta格式的序列，填寫好相關參數。
3.點擊“Get primers”NCBI就會彈出來告訴你，這樣的參數選擇會擴增到其他剪切變體，我們勾選不同的剪切變體并提交，就可以獲得合適的引物對了�。ㄈ缦聢D）
這些引物對的退火溫度，都在60℃左右。根據實驗目的，選擇長度適中、特異性好和引物自身互補較少的引物進行實驗，成功率還是相當高的呢！
第四步：引物特異性驗證
Primer-Blast除了可以設計引物外，還可以對我們自己設計的引物進行評價。返回引物設計的頁面，輸入我們設計好的上下游引物，其它參數不調整，提交后就可以看到這對引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都顯示在我們想要擴增的基因中，說明這對引物的特異性棒棒噠！(舉例引物查詢結果只此一條噢！）
引物的擴增效率達到90%-110%即認為擴增效率較好，熔解曲線單峰且通常Tm>80℃即認為擴增特異性較好。相當簡單有木有啊～是不是感覺自己已經告別科研小白的身份，瞬間掌握了qPCR引物設計的絕招啦。
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擎科生物基于多年qPCR檢測服務經驗，對常見人源細胞信號通路相關基因進行了系統性的qPCR引物驗證，經多次篩選驗證，可提供擴增效果好、特異性高的引物庫套裝，助您的實驗事半功倍。訂購5對引物即可贈送500 µL 2×qPCR Mix。
