ZenoTOF™ 7600系統配備的Zeno Trap（Zeno阱）功能激活后，可以使SWATH DIA工作流程中的肽段二級質譜靈敏度提高5-6倍左右，使得蛋白質組學工作流程平臺中使用納克甚至皮克級樣品量成為可能。我們應用Zeno SWATH IDA流程，對低進樣量K562樣品進行分析，使用納升液相系統進行蛋白質鑒定和定量測試，并且評價了DIA-NN中使用基于自建數據庫和非自建庫的分析流程。
 

• 液相方法：液相系統：M Class系統（Waters），色譜柱：EV-1106 色譜柱，15 cm x 150 μm，1.9 μm 粒徑，流速：300 nL/min，梯度：45min。

  

• 質譜方法：質譜：ZenoTOF™ 7600系統，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口數：80個（m/z 400-903），一級累積時間：50毫秒，二級累積時間：18毫秒，源氣參數：離子源電壓3200 V，溫度225°C，Gas1 ：10 psi ，CUR gas ：20 psi。

 

• 數據分析：Zeno SWATH DIA數據使用DIA- NN軟件處理，分別使用自建數據庫和非自建庫流程，自建數據庫為之前由OneOmics建立的人細胞裂解液數據庫。

 
 
1.  低進樣量時蛋白質鑒定和定量數量

在不同進樣量時測試蛋白質鑒定和定量數量，可以看到在250 pg進樣量時，K562樣品可以鑒定到880個蛋白質( FDR<1%)，其中327個蛋白質CV低于20% ( 圖1)。隨著樣品進樣量的增加，蛋白質鑒定數量增加，進樣5ng時鑒定出3752個蛋白( FDR<1%)，其中2457個蛋白CV低于20%。空白樣品按照相同條件進行分析，未檢測到蛋白或多肽，說明工作流程可靠性。
   
左圖透明柱狀圖代表global FDR<1%時蛋白質鑒定數量，實心柱狀圖代表FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質數量。
 
 
2.  采用自建數據庫和非自建庫時蛋白質鑒定數量對比

使用DIA-NN分別進行基于自建數據庫的數據處理，以及直接從人類FASTA文件中生成理論數據庫的分析。總體而言，兩種數據處理方法蛋白質鑒定的重疊程度很高，使用自建數據庫處理的蛋白質鑒定數量略多(約4%)（圖2），二者共同鑒定到的蛋白質為819個。
   
 
3.  Zeno SWATH IDA流程穩定性測試

通過比較間隔1個月進樣的2組實驗來評估低進樣量實驗的日間重復性，每次實驗對相同的K562原液進行稀釋，使用Zeno SWATH DIA進行分析。可以看到，在3種低進樣量下，觀察到相近的蛋白質鑒定數量（圖3）。
   
兩組實驗中，每個進樣量樣品均進行3次采樣。數據在DIA-NN軟件中使用基于自建數據庫的流程進行數據處理。透明柱狀圖表示global FDR <1%的蛋白質鑒定數，實心柱狀圖帶表示FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質數。