mRNA作為疫苗，可被廣泛應用于傳染病、腫瘤以及蛋白替換療法等領域。
1）傳染病領域。mRNA疫苗能夠靶定病毒的保守區域，直接在細胞中表達特定抗原，激活機體的免疫應答產生抗體，從而達到預防傳染性疾病的目的；
2）抗腫瘤領域。抗腫瘤mRNA疫苗根據作用機理一般分為兩類，基于樹突狀細胞（DC）給藥的mRNA疫苗和直接注射的mRNA疫苗；
3）蛋白替代療法領域。通過將人體變成自身蛋白加工廠，從而治療一些罕見病。

實際上，早在COVID-19大流行之前，mRNA疫苗就以其獨特的優勢吸引了大量制藥公司參與研發。而如今，mRNA疫苗在新冠領域的成功極大地刺激和推動了mRNA技術的發展和擴張。

迄今為止，mRNA藥物生產全過程均較少公開，mRNA原料藥生產平臺的設計分為2個關鍵開發領域，上游酶法工藝和下游色譜和超濾純化；純化的mRNA被包封成脂質納米顆粒（LNP）得到最終制劑。mRNA構建體旨在整合許多有助于降低非特異性免疫激活和提高翻譯效率的因子。為了降低先天免疫系統的激活，該方法整合了N1-甲基假尿苷修飾核苷；為了提高可翻譯性，質粒被設計為編碼目標編碼序列含5和3'未翻譯區域（UTR）和整個Poly（A）尾巴，確保是在人類細胞翻譯的最佳尾長。
新冠病毒的抗原為S蛋白，需要設計與構建含有S蛋白基因序列的載體，然后通過大腸桿菌放大培養，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質粒。
質粒生產是mRNA疫苗生產的重要一步，早在2020年時，為滿足這一需求，由迪必爾生物從事十多年原核發酵從研發、中試、大規模商業化生產全過程發酵工作經驗的應用支持專家，結合質粒發酵特點，自身實驗過程情況，給出質粒開發思路的系統性并具有實驗可行性的參考方案，為質粒開發人員撰寫IND申報研究方案與研發報告提供參考模板。  

發酵實驗簡介：質粒小試工藝研發工作需由專業研發人員完成。整個實驗過程遵循GLP的基本原則。總體思路，參照中國藥典與相關文獻，對質粒生產進行小試開發工作，在1.3 L平行反應器中進行培養優化，通過平行反應器篩選，改善產品質量并對每個質粒生產進行工藝參數確認，進而獲得可用于中試生產的小試培養工藝。
發酵實驗原理：應用大腸桿菌的生長規律與代謝途徑，使外源基因質粒在大腸桿菌中擴增。利用質粒DNA分子可以持續穩定地處于染色體外的游離狀態，隨著染色體復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代的規律，對大腸桿菌進行培養，使重組質粒在大腸桿菌中表達。通過平行生物反應器工藝優化來控制微生物的生長速率，來提高質粒分離與結構的穩定性，以提高質粒的表達量。

發酵實驗目的：通過1.3 L平行反應器培養，對每個質粒生產進行工藝參數摸索與確認，同時可以獲得用于中試放大生產的質粒小試培養工藝。
實驗方法與步驟：凍存菌解融后按1:1000比例接種種子液，種子液長好后按照2:100比例移入滅菌好的裝有600ml改良LB培養基的反應罐內。初始溫度37.0±1.0℃、控制pH 6.9±0.2，溶氧關聯攪拌、補料。
 
跳過搖瓶采用1.3 L*8聯平行生物反應器培養，通過DOE實驗設計，采用指數補料策略，可以實現高密度發酵，增加質粒DNA的穩定性，提高質粒DNA的產量，是搖瓶的50倍以上。取樣檢測質粒表達水平，每1小時取樣測量一次OD600值，記錄下時間、溫度、pH、轉速、溶氧、OD600值，補料流速等數據。OD600值達到20以上每個取樣點抽測質粒含量。
通風和攪拌的目的是為了提供菌株生長和代謝所需的氧，大腸桿菌培養在指數生長期對氧的需求量很大，因此及時有效的調節生物反應器通氣和攪拌可影響發酵周期的長短和代謝產物生成的高低，足夠的溶氧是實現大腸桿菌高密度發酵的關鍵因素之一。
可靠有效而經濟的供氧是極為重要的，控制系統可以改變氣體組成中的氧含量，從DO變化情況可以實時了解氧的供需規律及其對生長和產物合成的影響。初始底物消耗完后開始補加甘油溶液/優化復合補料溶液，生長停止結束發酵。 放罐后于4℃環境，4000rpm離心20min，收集離心杯中的菌體，棄上清。進行各發酵數據對比、工藝重現即可完成上游小試工藝確認。

根據1.3L反應器規模工藝優化，對申報確定菌種進行工藝確認，本階段為一系列實驗后的工藝總結，一般使用WCB菌種及階段報告確定的工藝來完成小試工藝的確定。確定反應器參數以及補料策略等關鍵控制參數。

質粒DNA的規模化生產通常是在高密度發酵情況下進行的，通過小試規模得到菌種發酵的基本信息和優化條件后，進行規模的放大。對于臨床I期的生產，采用了GMP放大方法，典型的I期生物工藝為1.3L至200L，下游處理規模為2L至10L。通過該開發工藝生產的產品，在生產環境中執行GMP并在符合GMP的條件下轉入生產時，均符合穩定性測試的驗收標準。 2022年4月29日，斯微生物發布公告，宣布其自主研發迭代的新冠病毒mRNA疫苗獲得國家藥監局批準，將開展臨床試驗。（https://m.gmw.cn/baijia/2022-05/04/35708026.html）
祝賀迪必爾合作伙伴斯微生物新冠疫苗再次獲得我國臨床批件！ 大疫三年,新冠病毒不斷變異，疫情持續反復，國內mRNA新冠疫苗研發企業們日夜奮戰，近期疫情下的上海等城市的生物公司研發人員們平均閉環生產（吃住都在工廠）達50天以上；所面對的困難挑戰可想而知，不光生活上的，還有實驗開展供應鏈上的挑戰。我們作為鏈條上的一環，雖然能解決的問題與價值不一樣，但目的大家應該是一致的：研發出對抗原始株和變異毒株更有效的新冠疫苗從而終結這場讓百姓苦不堪言的疫情！
參考文獻：
1.    Whitley,Jill et al. “Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics:mRNA platform requirements and development of a scalable production process tosupport early phase clinical trials.” Translational research : the journal oflaboratory and clinical medicine vol. 242 (2022): 38-55.doi:10.1016/j.trsl.2021.11.009