生物創(chuàng)新藥的開發(fā)是一個復雜的過程，而構建一個適合于生產(chǎn)的高表達穩(wěn)定細胞株是第一步，也是關鍵的一步。挑選到理想的高表達克隆后，就要開始選擇商業(yè)化培養(yǎng)基或者定制培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)優(yōu)化。高通量、標準化、自動化的細胞培養(yǎng)和工藝優(yōu)化能幫助我們在獲得更準確結果的同時加速細胞株開發(fā)進度。

Ambr® 15 高通量全自動細胞培養(yǎng)
Ambr®15細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是全球?qū)嶒炇移毡閼�用的行業(yè)標準微型生物反應器系統(tǒng)。作為一個自動化、高通量的一次性生物反應器系統(tǒng)，其能夠以10-15mL的體積模擬大規(guī)模生物反應器所提供的功能和工藝控制。該系統(tǒng)兼具并行處理能力和卓越的重現(xiàn)性，可快速實現(xiàn)包括實驗設計(DOE)研究在內(nèi)的高通量工藝優(yōu)化，可有效縮短時間、減少試劑使用量并節(jié)省人工成本。

Octet® 非標記分子互作分析系統(tǒng)
Octet®系統(tǒng)采用非標記、無流路的生物層干涉（BLI）技術，采用浸入即讀的檢測方式，是列入美國藥典的分子相互作用檢測標準。基于生物層干涉技術原理，通過監(jiān)測生物傳感器表面的生物分子結合所帶來的膜層厚度變化來檢測分子間相互作用的動力學變化或者濃度數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)在生命科學領域應用非常廣泛。這些領域包括受體與抗體、病毒顆粒、重組蛋白和許多其他生物分子結合的動力學和親和力常數(shù)分析。

本應用中，介紹了如何使用Ambr® 15高通量全自動細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和Octet®非標記分子互作分析系統(tǒng)聯(lián)合進行培養(yǎng)基篩選和工藝優(yōu)化，加速細胞株開發(fā)工作流程，以最快速度篩選出高產(chǎn)量高質(zhì)量的單克隆細胞株（圖1）。
 
實驗1
  Ambr® 15細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

生物反應器溫度：36.8℃ 接種細胞密度：3E5cells/mL 培養(yǎng)體積：13mL PH：7.0(上限為7.1) DO：40% 壓載氣體流速：0.15mL/min 攪拌速度：1300rpm 每天添加消泡劑和補料（見圖2）

圖2

 
Octet®中的產(chǎn)量(滴度)測定 

儀器機型：Octet® R8 傳感器類型：ProteinA/ ProteinG 定量時間：120s 樣品板溫度: 30℃

 
在本實驗中，2個克隆在5種不同培養(yǎng)基中使用XR進行細胞計數(shù)，同時使用Octet®進行滴度測定。

結果與討論

本應用通過對兩個不同的克隆進行五種不同的培養(yǎng)基組合評估，證明了聯(lián)合使用Ambr® 15和Octet®在一項實驗中進行多種條件的便利、簡單和速度。

克隆1的結果（圖3）表明，五個培養(yǎng)基中活細胞計數(shù)和細胞活率基本一致，培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基5中的最高細胞密度略高。產(chǎn)品滴度結果（圖3B）表明，培養(yǎng)基5是生產(chǎn)mAb表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基。這與細胞特定生產(chǎn)率（Qp）（圖3D）結果完全一致。
  圖3. 克隆1在不同培養(yǎng)基中的細胞計數(shù)和滴度分析。使用XR進行細胞計數(shù)，同時使用Octet®進行高通量滴度測定。

克隆2的結果（圖4）顯示，在五種培養(yǎng)基中，細胞生長情況相當，直到第6天以后，培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中的活細胞密度峰值和細胞活率都超過了其他培養(yǎng)基。對于這個克隆，培養(yǎng)基3、4和5中的細胞活率從第8天起就開始下降。培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中都有較高的產(chǎn)品滴度，但總體而言，培養(yǎng)基2在第8天后具有較高的生產(chǎn)力，導致較高的Qp（細胞特定生產(chǎn)率）數(shù)值（圖4D）。
  圖4. 克隆2在不同培養(yǎng)基中的細胞計數(shù)和滴度分析。使用XR進行細胞計數(shù)，同時使用Octet®進行高通量滴度測定。

兩個克隆的比較表明，克隆2達到的最大產(chǎn)品滴度是克隆1最大滴度的兩倍以上。然而，如果選擇培養(yǎng)基5作為最佳培養(yǎng)基，那么結果表明克隆2具有較低的性能，因為培養(yǎng)基5與該克隆組合時的生產(chǎn)率較低。因此，不應低估一起篩選多個克隆和不同培養(yǎng)基類型的影響，因為產(chǎn)品性能會有很大的不同。

實驗2
   
Ambr® 15細胞培養(yǎng)系統(tǒng)
生物反應器溫度：36.8℃
接種細胞密度：3E5cells/mL
培養(yǎng)體積：12~14 mL
PH：7.0(上限為7.1)
DO：40%
壓載氣體流速：0.05~0.25mL/min
攪拌速度：1050~1650rpm
每天添加消泡劑和補料

Octet®中的產(chǎn)量(滴度)測定

儀器機型：Octet® RH96 傳感器類型：ProteinA/ ProteinG 定量時間：120s 樣品板溫度:30℃

在本實驗中，攪拌速度、壓載氣體流速和起始體積是一項實驗中可變的所有因素。我們通過MODD®軟件設置DOE。
 

工藝參數(shù)	范圍
攪拌速度	1050 - 1650 rpm
通氣速率（空氣）	0.05 - 0.25 mL/ min
起始體積	12 - 14 mL
響應	Qp（細胞特異性生產(chǎn)率）

結果與討論

本研究利用Ambr® 15中的DOE MODDE®軟件快速建立一個實驗設計，改變相關生物工藝條件。在整個過程中使用Octet® 檢測產(chǎn)量(滴度)，可立即進行數(shù)據(jù)分析和進一步的實驗計劃，并對項目安排產(chǎn)生積極影響。

響應輪廓圖（圖5）顯示了攪拌速度和通氣速率組合如何影響Qp。在低速攪拌時，增加通氣（空氣）的流速有一個微小的但積極的影響，當攪拌速度增加到1200 rpm時，氣體的流速似乎沒有影響。然而，在最高的攪拌速度下，其實際上對Qp有不利的影響，較低的氣體流速是可取的。總的來說，在較高的攪拌速度和較低的氣體流速下，可看到最高的細胞特定生產(chǎn)率。
主效應圖是一個單一工藝變量的各個水平下的平均響應值的圖。本研究中攪拌速度的主效應圖（圖6A）表明隨著攪拌速度提高到約1500rpm，之后細胞特異性生產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。雖然在較高的攪拌速度下獲得了最大的Qp，但對于這個特定的克隆，較高的攪拌速度產(chǎn)生了較強的剪切力，細胞活率也會下降很快。起始體積的主效應圖（圖6B）顯示，較低的培養(yǎng)體積提供了較高的Qp（每個細胞的收率較高）。在Ambr®15細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，頂空體積和液體體積之間的界面面積對整個罐體kLa的貢獻比大型生物反應器要大。此外，較低的工作容積，在相同的攪拌速度下，單位體積的功率輸入上升，這意味著直接用于破壞和促進氣泡在液體中懸浮的能量輸入更大，這也將對kLa做出重要貢獻。因此，在工藝優(yōu)化過程中，必須仔細考慮培養(yǎng)體積與其他參數(shù)的關系。
  圖6. （A）攪拌速度和（B）起始體積的細胞特定生產(chǎn)率（Qp）的主效應圖。在MODDE®軟件中進行分析。

總結
Ambr® 15高通量全自動細胞培養(yǎng)系統(tǒng)集成了XR和Ambr® 分析模塊，功能強大；Octet®高通量分子互作分析系統(tǒng)，在培養(yǎng)基篩選和工藝優(yōu)化實驗中快速確定最佳收率條件，與全新推出的Octet® GlyS和GlyM試劑盒相結合，還可評估關鍵質(zhì)量屬性。加速整個細胞株開發(fā)流程，為新藥上市賦能。

二者的主要優(yōu)勢有：

• 實驗流程簡化，具備并行篩選多種條件的能力；
• 控制性能提升，包括pH和DO在內(nèi)的工藝參數(shù)；
• 樣品無需處理，大大縮短了分析時間，Octet® RH96上可在5分鐘內(nèi)獲得多達96個樣品檢測；
• 工藝優(yōu)化中，證實了Octet®與Ambr®15在MODDE®軟件上聯(lián)合使用是評估各種參數(shù)的理想組合。

下載
下載應用指南《高效細胞株開發(fā)：結合Ambr® 15 細胞培養(yǎng)與Octet® 滴度測定加速工藝優(yōu)化》了解更多高效細胞株開發(fā)策略