新型重組鱟試劑檢測方法PSNG、rFC與LAL之間的比較
在制藥過程中，細菌內毒素的檢測依賴于鱟血資源。隨著注射劑、疫苗類、化學藥品類等制劑品的需求不斷增長，鱟血資源的使用率越來越高；同時，鱟試劑中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子導致的假陽性結果。所以，建立一套不依賴鱟生物進行細菌內毒素檢測的快捷、高效的補充替代方法尤為重要。
作為新型的重組鱟試劑檢測方法：PSNG、rFC則備受關注。
一、PSNG和rFC的概念
01 PSNG
PSNG（基因重組鱟試劑）是一種基因工程技術合成的細菌內毒素定量檢測試劑，該試劑不依賴鱟血資源，滿足可持續發展的目標。
它完全模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯反應，包含C因子、B因子、凝固酶原，是唯一一種擁有與傳統鱟試劑相同酶聯反應,同時又消除了與1,3-β-D-葡聚糖交叉反應造成假陽性結果的內毒素檢測試劑。
PSNG（上圖右側）成功去除了天然鱟試劑
（上圖左側）的G因子干擾。
02 rFC
重組C因子法（rFC）是通過體外重組鱟凝血級聯反應的第一個組分：C因子，激活的C因子直接剪切一個熒光底物，產生的信號被熒光酶標儀識別。相較于傳統的動態LAL法，重組C因子法只有一種反應機制。
右側為重組C因子試劑
二、LAL、PSNG、rFC
對比情況
作為新型的重組鱟試劑PSNG、rFC，與傳統的鱟試劑LAL進行細菌內毒素檢測時又會有什么不同呢？
01 PSNG與LAL在檢測內毒素上比較
（圖1）
由圖1所示，通過研究在顯色底物存在下，使用三種重組酶原的多種組合，確定三種重組酶原是否能重建反應步驟。
結果證實，當三種重組酶原同時存在時，內毒素才能激活蛋白酶活性，得出了PSNG與LAL在檢測內毒素上具有等效性。另外，研究證實了，三種重組酶原的蛋白酶活性大大增強，信號放大。
02 LAL、PSNG、rFC
對內毒素敏感度比較
（圖2）
從反應機制上看，rFC缺少了級聯放大的兩個環節（加速反應），只能通過熒光檢測人為放大（減少了來源于自然反應的特異性）。
如圖2所示，凝血酶的活化是LAL信號放大的主要驅動力；B因子的活化是針對內毒素的特異性活化，由此可以得出，PSNG敏感度比rFC更高。
03 PSNG與LAL檢測時間比較
（圖3）
如圖3所示，通過對一系列濃度RSE（細菌內毒素參考標準品）應用PyroSmart NextGen™（PSNG）和典型動態顯色試劑檢測得到的起始時間值，得出PyroSmart NextGen™較典型的動態顯色試劑檢測縮短了大約一半的時間。
04 PSNG與LAL批間一致性比較
（圖4）
天然來源的LAL試劑具有固定的批次間變異性，而PyroSmart NextGen™試劑表現出批次間的一致性。圖4所示，六個單獨批次的PyroSmart NextGen™試劑的曲線標準趨于一致，證明PSNG具有重復性和可預測性的性能。
05 PSNG與LAL對內毒素特異性比較
（圖5）
圖5的X-Y軸分別表示的是加標/不加標1,3-β-D葡聚糖的各批次PyroSmart NextGen™和系列標準濃度的反應。結果顯示了添加1,3-β-D葡聚糖對應用PyroSmart NextGen™對內毒素的檢測不存在干擾，各批次間相關性良好。
06 PSNG驗證性能
（圖6）
（圖7）
如圖6、圖7所示，應用PyroSmart NextGen™在50-0.005 EU/mL內毒素范圍內，在兩批次、四個分析人員、三天內條件下，執行了24個性能驗證實驗。依據ICH Q2指南標準，結果顯示各驗證參數滿足標準要求。
07 PSNG、rFC、LAL
針對檢測樣品的比較
（圖8）
（圖9）
（圖10）
圖8、圖9、圖10所示，適合性/一致性研究測試了多個成品、水、緩沖液等樣品，得出PyroSmart NextGen™較 LAL具有相等或較低的不干擾稀釋倍數(NID)。另外，Muroi 等人報告了使用PyroSmart NextGen™前身 PyroSmart 試劑檢測藥典118種腸外注射藥物得出了相似的結果。
基于以上數據得出結論，重組鱟試劑方法(rCR)適合于廣泛的產品檢測。可比性研究測試了多種來源的細菌內毒素和水樣，證實應用PyroSmart NextGen™檢測具有較好的相對回收率。
08 PSNG、LAL、rFC方法對比
（圖11）
如圖11 所示，PSNG優于重組C因子法。PSNG檢測過程不需要更換方法和設備，就能繼續同樣的工作流程。
三、總結
從LAL、PSNG、rFC對比情況來看，PyroSmart NextGen™較rFC、LAL在細菌內毒素檢測上具有較強的優勢：
相比重組C因子內毒素檢測方法，PyroSmart NextGen™內毒素檢測試劑可以產生級聯放大反應，使得內毒素檢測更加高效和靈敏。
文章參考來源：PYROSMART NEXTGEN RECOMBINANT LAL REAGENT
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