分子生物學研究對提取RNA要求較高，純度高、完整性好、含量高的RNA是獲得實驗成功的關鍵和前提。小編給各位小伙伴總結了以下RNA提取常見問題及RNA質量的評估方法：
 

常見的RNA提取方法有異硫氰酸胍-苯酚法（Trizol法）、離心柱法和磁珠法。Trizol法是動物組織及動物細胞總RNA提取最常用的方法。Trizol法裂解能力較強，尤其適合小樣本及特別難提取的組織，如皮膚，動物結締組織等總RNA的提取；另外Trizol作為一種通用型的裂解試劑，還可以用于植物組織、細菌、真菌等組織的提取。離心柱法是一種十分穩(wěn)定的RNA提取方法，電泳條帶較為均一，但分子量較小的RNA會被過濾掉。磁珠法是使RNA與納米磁珠結合，在磁場作用下，磁珠-核酸復合物與液體分離，再把核酸從磁珠上洗脫下來。對于含多糖多酚的植物組織如油茶、茶葉、油菜等還可以使用CTAB法進行總RNA的提取。那么在RNA提取過程中如何防止RNA降解，保證RNA質量？
 

如何避免RNA降解？

1.避免RNA酶的產生：

A 、避免內源性RNAase：

內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因。收集樣本時，內源性RNA酶釋放，降解RNA，降解速度與酶含量和溫度有關，所以收集樣本時必須馬上進行內源RNA酶的失活。內源性RNAase失活方法：①迅速研磨破碎后加入裂解液中保存；②立即切成小塊投入液氮中保存；③使用RNAlater保護劑等。

B、避免外源性RNAase：

使用無RNase的塑料制品和槍頭，玻璃器皿要消毒避免交叉污染，注意：戴帽子、戴口罩、橡膠無菌手套，在清潔灰塵少的試驗臺提取。

2.提高RNA提取效率：

A 、組織RNA提取：

選用新鮮組織，這樣RNA提取的效果比較好；如果不是新鮮的(最好在半年之內，-80℃或者液氮中凍存的)組織，注意不要反復凍融，從冰凍狀態(tài)拿到0-4℃，待組織解凍后，用DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織，稱重后，放到預冷的勻漿器中，進行勻漿處理。注意：速度不要太快，要有間隙，否則由于摩擦產熱，RNA遇熱會加速降解。如果一次做多個標本的RNA提取，也要這樣做，更不能急。后面的步驟和細胞RNA提取一樣。

B、培養(yǎng)細胞的RNA提取：

貼壁細胞，需要先用胰酶消化后，然后收集到離心管中，離心，去上清然后用PBS多洗2-3次，以去除多余的胰酶。懸浮細胞，直接用吸管或者加樣槍吹打，以使細胞基本可以被吹下來。然后離心去上清，不需要用PBS洗。

如何確認RNA質量的好壞?

1. RNA溶液純度的檢測：

RNA溶液在280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般我們通過OD260/OD280的值來判斷RNA純度：

OD260/280的值在1.9-2.1之間，認為RNA純度較好；

OD260/280的值小于1.8時，表明蛋白質雜質較多；

OD260/280的值大于2.2時，表明RNA已經降解；

注意：如果用TE溶液洗脫RNA，會使OD260/280的值偏大。

2. RNA完整性的檢測：

1）通過瓊脂糖凝膠電泳檢測28s和18s條帶，28s條帶寬度為18s條帶的兩倍；

2）通過色譜方法檢測，RIN值：28s/18s為1.8-2.0，表明RNA完整性較好，基本無降解發(fā)生。

 

RNA電泳帶型的特征：

☑RNA應該呈現(xiàn)出3條rRNA帶。分別是5、18、28SrRNA條帶。

☑28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例關系均提示RNA有一定程度的破壞。

☑不能有多的帶出現(xiàn)，出現(xiàn)多的帶有兩個可能:一是DNA污染帶;二是rRNA破壞斷裂帶。

☑rRNA之間可以看到很淡的、霧蒙蒙的mRNA拖帶。

☑ 瓊脂糖凝膠被RNAase處理后電泳帶基本消失，沒有明顯的、邊緣清晰的帶殘留(如果有殘留就是明顯的DNA污染，而且是很大量的 DNA污染。
 

參考文獻：

[1]Vermeulen J, De Preter K, Lefever S. Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR[J]. Nucleic Acids Res 39 2011 :e63.

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