隨著“人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃”的提出，越來(lái)越多的科研人員將關(guān)注力放在蛋白質(zhì)組學(xué)上，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)功能的執(zhí)行者，從蛋白質(zhì)的角度去研究生命的活動(dòng)已經(jīng)成為大生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要分支。關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，很多老師、同學(xué)有或多或少的疑問(wèn)，那么小編將大家經(jīng)常咨詢的問(wèn)題匯總一下，供各位老師、同學(xué)參考。

Q1：什么樣本能做蛋白組學(xué)檢測(cè)？大概可以測(cè)到多少的蛋白種類？

A:原則上只要能提取到蛋白，就可以做蛋白組檢測(cè)。樣本測(cè)到的蛋白種類跟數(shù)據(jù)庫(kù)和樣本本身蛋白濃度有關(guān)，一般數(shù)據(jù)庫(kù)越大，可以鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量越多。也與樣本的類型有關(guān)，通常，組織細(xì)胞相比于體液樣本，能夠鑒定到更多的蛋白。

Q2：蛋白組學(xué)樣本寄送前是否需要精確計(jì)數(shù)或是稱量？

A:不同樣本寄送會(huì)有不同的送樣要求，按照收集方法提供可以保證實(shí)驗(yàn)用量充足。不需要精確計(jì)數(shù)或是稱量，項(xiàng)目開(kāi)展前會(huì)進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，后續(xù)也是不同樣本等蛋白量處理、上機(jī)檢測(cè)，但是要保證每個(gè)樣本的寄樣量達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

Q3：我的樣本不知道有沒(méi)有降解，量夠不夠？

A:常規(guī)蛋白組檢測(cè)項(xiàng)目，我們會(huì)進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，確定蛋白量是否夠用于后續(xù)的檢測(cè)。同時(shí)也會(huì)進(jìn)行SDS-PAGE跑膠查看蛋白是否有降解，條帶是否明顯，如果蛋白量不夠或者膠條有異常，會(huì)及時(shí)跟客戶反饋，溝通解決方法。

Q4：哪些樣本需要去除高豐度蛋白？

A:血清、血漿、腦脊液等體液樣本，高豐度蛋白比例達(dá)到97%~99%，包括白蛋白、免疫球蛋白、IgG、IgA、抗胰蛋白酶、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。高豐度蛋白的存在會(huì)影響低豐度蛋白的檢測(cè)，而低豐度蛋白往往是比較關(guān)注的生物標(biāo)記物或者藥物靶點(diǎn)，常規(guī)是建議去除高豐度蛋白再檢測(cè)。

Q5：膠條樣本如何送樣檢測(cè)？

A:可以切關(guān)注的部分條帶檢測(cè)，也可以單個(gè)樣本整個(gè)泳道進(jìn)行檢測(cè)。如果是整個(gè)泳道檢測(cè)，建議至少分成兩份檢測(cè)，重輕鏈一份，其他一份，可以增加檢測(cè)深度。膠條的寄送采用冰袋運(yùn)輸。

Q6：血清血漿樣本如何選擇？

A:都可以選擇使用，血漿含有纖維蛋白原，在血清中檢測(cè)到的蛋白的豐度相對(duì)于血漿來(lái)說(shuō)更高一些，一些比較微量的蛋白可能血清可以檢測(cè)出。但是血清的操作步驟相對(duì)比血漿而言更復(fù)雜一些，可能會(huì)帶來(lái)人為誤差。

Q7：Label Free/TMT&iTRAQ/DIA產(chǎn)品如何選擇？

A:Label free和TMT&ITRAQ屬于數(shù)據(jù)依賴型采集模式（DDA），通常選擇TOP N個(gè)母離子肽段進(jìn)行二級(jí)碎裂檢測(cè)，DIA產(chǎn)品屬于數(shù)據(jù)非依賴型的質(zhì)譜采集方式，全部母離子都可以進(jìn)入二級(jí)破碎，能夠定性到的蛋白數(shù)量可能會(huì)更多，依賴于建庫(kù)數(shù)據(jù)；

與標(biāo)記蛋白組相比，DIA和label free均不會(huì)受限于樣本數(shù)量；與label free技術(shù)相比，DIA的可重復(fù)性更高。建議樣本數(shù)量比較大的時(shí)候選用此技術(shù)。樣本數(shù)量較小的時(shí)候，如果樣本之間差異比較大，需要查看蛋白的有無(wú)信息，推薦做label free產(chǎn)品。

如果樣本例數(shù)不多，想進(jìn)行深度檢測(cè)，定性定量更準(zhǔn)確，建議標(biāo)記定量產(chǎn)品。

Q8：標(biāo)記產(chǎn)品最多可以做多少樣本？

A:目前標(biāo)記試劑盒主要分為T(mén)MT/iTRAQ兩種，試劑盒一次最多可以標(biāo)記16個(gè)樣本，如果超過(guò)16例，可以通過(guò)搭橋樣本來(lái)實(shí)現(xiàn)批次間的校正。

Q9：物種如何選擇數(shù)據(jù)庫(kù)？

A:常規(guī)是使用uniprot網(wǎng)站該物種的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)作為搜庫(kù)文件，如果該物種的數(shù)據(jù)庫(kù)比較小或者沒(méi)有數(shù)據(jù)庫(kù)，可以選擇以下三種解決方案：（1）擴(kuò)大物種的層級(jí)，選擇上一層級(jí)或是更大層級(jí)的物種庫(kù)；（2）選擇近源物種庫(kù)；（3）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果作為數(shù)據(jù)庫(kù)。有些個(gè)別的物種有專門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站也可以采用去進(jìn)行搜庫(kù)分析。

Q10:常規(guī)定量蛋白組實(shí)驗(yàn)的主要步驟有哪些，主要采用哪些儀器檢測(cè)？數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包含哪些？

A:實(shí)驗(yàn)步驟：首先獲得生物學(xué)樣本，然后進(jìn)行蛋白提取，定量，SDS-PAGE跑膠質(zhì)控，還原烷基化，酶解，獲得肽段，（標(biāo)記+分組分），上機(jī)檢測(cè)，搜庫(kù)軟件搜庫(kù)，數(shù)據(jù)分析；

儀器：主要采用Q Exactive™ HF-X 、Orbitrap Fusion™、Orbitrap Exploris™ 480等；

數(shù)據(jù)分析：主要分為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析、⾼級(jí)數(shù)據(jù)分析和個(gè)性化數(shù)據(jù)分析三個(gè)部分。基礎(chǔ)分析主要包括差異表達(dá)蛋白篩選、層次聚類分析分析、COG注釋分析、亞細(xì)胞定位分析、GO注釋富集分析、KEGG注釋分析、PPI分析等。