人類遐想通過冷凍保存，實現在未來復活。在科幻小說《三體》中，描述了人類可以在冬眠中度過幾個世紀，醒來之時依然保持著冬眠時的生命體征和生理年齡。漫威電影里的美國隊長冰封70年后再次蘇醒，拯救世界。

看似神秘的冷凍保存技術，對于做細胞培養的小伙伴而言是一點也不陌生，細胞凍存可是人人不能免考的必修課呀。

01  細胞凍存的原理
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，也是保持細胞活性和增殖能力的重要手段。細胞可以通過被暫時休眠（凍存），仿佛童話里的睡美人，留住年輕芳華，等到需要時再被輕輕喚醒（復蘇）。

低溫下，活細胞中的生物和化學反應都會大大降低，為細胞長期凍存提供了可能。冷凍對大多數活生物體都是致命的，細胞凍存是利用冷凍保護劑來降低冰點，緩慢凍結細胞的過程中，細胞內水分透出細胞，使細胞凍結中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對細胞中生命活性物質的一系列損傷。【1】細胞凍存時利用低溫降低細胞代謝，使細胞處于停止生長的“休眠”狀態，等需要使用的時候再進行復蘇操作。

細胞儲存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若儲存在-196℃的液氮環境中，理論上可以實現長期永存。

02  細胞凍存的常見方法
細胞凍存和復蘇的關鍵要點是慢凍快融。細胞凍存的效果主要與降溫步驟、凍存保護液的使用、凍存溫度、復溫速率及用于凍存的細胞生長狀態有關。【2】降溫速率過快容易引起細胞內冰晶損傷，所以為防止細胞內結冰必須采用一個“慢”的降溫過程，并使用凍存保護劑，即凍存液。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護劑。

根據降溫速度區分，細胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統的凍存方法是將冷凍管置于4℃ 30分鐘、-20℃ 30分鐘、-80℃過夜再轉液氮。這種凍存方法步驟多，而且需要遵守幾個時間點，容易被遺忘，對于繁忙的實驗人員而言不那么友好。而程序降溫方法，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。常規的程序降溫凍存方法較為復雜、費時，需要儀器設備花費較高，所以非程序降溫凍存方法便應運而生，它能大大簡化凍存流程，細胞可直接置于-80°C冰箱完成凍存過程，更為簡便高效。

03  細胞凍存和復蘇的最佳時間
細胞在體外生長期間，通常分為三個階段：潛伏期、指數生長期和平臺期。潛伏期通常是細胞剛剛傳代，此時細胞開始貼附基質和伸展骨架，代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達，細胞數量在這段時間內幾乎沒有增加。

隨后，細胞開始指數生長期，轉錄翻譯過程旺盛，胞內物質、信號傳遞迅速，細胞數量迅速增長。如果在這個時期凍存，實際上是強行將細胞凍結在代謝的某一時刻，勢必造成對解旋的DNA、轉錄翻譯中的RNA和蛋白的機械損傷，增加個別環節發生錯誤的風險。

隨著細胞數量的增長，培養容器內，細胞匯合達到90%以上。大部分細胞因為“接觸抑制”而停止高速代謝和增殖，胞內活動趨于平緩。所以，建議在剛剛進入平臺期時凍存細胞，既可以獲得足量的細胞，也不會對細胞造成過多的機械損傷。

參考文獻：
1.吳敬智，繆著，馬波，劉馨.影響懸浮細胞冷凍保存的因素分析[J].中國生物醫學技術，2020,10（15）：512-517.

2.陳凱，李欣然，宣言. SD 大鼠骨髓間充質干細胞在-80 ℃低溫條件下的凍存[J].中國組織工程研究，2016，20(10):1433-1438.