FITC&AMC等熒光標(biāo)記技術(shù)
熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標(biāo)記的無放射物污染，操作簡便等優(yōu)點，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。肽谷生物經(jīng)過長期開發(fā)，能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
FITC&AMC等熒光標(biāo)記技術(shù)簡介
除了FRET熒光淬滅組合，肽谷生物還可以提供包括FITC, FAM, TAMRA, Biotin等種類齊全的多肽熒光標(biāo)記服務(wù)。
下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：
下表是一些熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長Ex(nm)和發(fā)射光波長Em(nm):
- · FITC修飾
- FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。
- 當(dāng)在N端標(biāo)記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。空間位阻被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。
- Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。
- · AMC修飾
- AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑， 與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進行：
- （1）AMC與肽鏈C端第一個氨基酸反應(yīng);
- （2）固相合成整條肽鏈（從第二個氨基酸開始），并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護基和最后一個氨基保護基；
- （3）液相縮合AA-AMC與全保護的肽鏈；
- （4）切除保護基，完成肽鏈的修飾。
通常，生物素、FITC等染料可任意標(biāo)記在多肽N端或C端。但我們推薦N端標(biāo)記，其成功率更高、所需時間更短、更易操作。由于多肽都是從C端往N端合成，所以N端修飾將是固相合成的最后一步，不再需要額外的偶聯(lián)步驟。相反，如果是C端標(biāo)記，則需要附加步驟，而過程會更復(fù)雜。
大多數(shù)染料都是大型的芳香分子，如此龐大分子的介入有助于避免標(biāo)簽和多肽之間的相互作用。這將有助于保持多肽的構(gòu)象和生物學(xué)活性。一般來說，推薦引入一個柔性間隔如Ahx(一個6碳化合物)會使熒光標(biāo)記更加穩(wěn)定。否則FITC將很容易與其他任何位置的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基發(fā)生連接。
