AAT Bioquest研發生產的最亮的鈣離子熒光探針Calbryte系列產品（代表產品：Calbryte 520、Calbryte 590 、 Calbryte 630）。Calbryte 系列是開發用于檢測細胞內鈣離子的熒光染料家族。這些指示劑的主要區別在于它們的激發和發射波長，它們均可以使用標準的熒光儀器進行檢測。Calbryte 系列已經經過優化，可用于熒光顯微鏡、熒光酶標儀和流式細胞儀，它們還可以用于高通量篩選應用。感興趣的朋友一起來看看吧！

Calbryte 系列染料與常見的Fluo-3和Fluo-4染料相比具有幾個關鍵優勢 。Calbryte 系列染料能產生更亮的信號，具有更優秀的信噪比，并大大增強了細胞保留能力。這些特點使Calbryte 系列染料成為傳統的鈣指示劑的絕佳替代品。
 

圖1.在Fluo-4，AM（左）和Calbryte 520AM（右）的CHO-K1細胞中測量ATP反應。將CHO-K1細胞以50,000個細胞/ 100 µL /孔在黑色96孔板中接種過夜。加入含丙磺舒的HH緩沖液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte 520 AM或含丙磺舒的HH緩沖液中的10 µg / ml Fluo-4，AM，并在37°C下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替換。加入ATP（50 µL /孔）以達到最終指示的10 µM濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。

Calbryte系列產品的命名

Calbryte 系列的染料是根據其最大發射波長命名的。例如，Calbryte 520在可見光譜的綠色區域發出熒光，而Calbryte 590和Calbryte 630在紅色和深紅色區域發出熒光。它們共有AM酯形式、鹽形式（以鉀鹽形式）。AM酯形式是可滲透細胞的形式，可用于檢測活細胞中的鈣離子。鹽形式主要用于校準鈣指示劑。根據熒光信號強度計算細胞內鈣濃度時，通常需要執行此步驟。鹽形式的Calbryte 也可以用于向活細胞和組織中進行顯微注射。

Calbryte系列產品在活細胞中的作用機制

當測定活細胞中的鈣離子時，合成具有幾個乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能團的Calbryte 染料。這樣做的原因有兩個。首先，AM酯是親脂性基團，當連接到Calbryte 核心結構時，會形成整體上更疏水的化合物。這種增加的疏水性使Calbryte AM酯易于滲透完整的脂質膜并滲透到活細胞中。這消除了對電穿孔、顯微注射或其他類似破壞性加載技術的需求；其次，Calbryte 染料雖然呈AM酯形式，但基本上是非熒光性且不可活化的。它們對存在于細胞外溶液中的微量Ca²⁺表現出最小的響應。只有當Calbryte 探針滲透到細胞中，并且只有在細胞內酯酶切割掉AM酯官能團之后，Calbryte 染料才被激活并對鈣離子有反應。這兩步激活過程非常重要，因為它極大地減少了非特異性背景熒光。并且通過擴展，它明顯增強了細胞內鈣離子信號；最后，一旦激活了Calbryte 探針，它就會通過典型的螯合過程檢測細胞中鈣的鈣離子。但是，與其他螯合劑（例如Fluo-3和Fluo-4）不同，Calbryte 染料在與鈣結合時會表現出更大的響應。在實驗中，Calbryte 探針在螯合后會表現出大于300倍的熒光增加。相比之下，Fluo-4僅表現出100倍的增長。熒光響應的這種明顯改善，使這種新型鈣離子檢測探針Calbryte對鈣的檢測極為穩定，這是過去的鈣指示劑無法實現的。

Calbryte系列產品的優勢

在活細胞實驗中，Calbryte 染料的信噪比比其他染料（例如Fluo-4）大一個數量級，在實驗研究中，這是一個巨大的優勢，因為較差的信噪比對數據分析來說是非常頭疼的問題。它將結果與其他信號混在一起，可能會遺失掉許多重要數據，并導致巨大的測定差異。因此，在選擇試劑時，大多數研究人員更喜歡信噪比高的試劑。

信噪比不佳可能是由多種因素造成的，這些因素主要分為兩類。第一類，存在導致信號強度差的因素。這些可以包括：

1. 低消光系數和量子產率
2. 與目標結合不佳
3. 遠離激發光源的最大吸光度（_λmax）

Catbryte 系列染料的開發，完美的解決了以上問題。例如，Calbryte 520的量子產率是Fluo-3和Fluo-4的三倍。這意味著Calbryte 520吸收的每個光子從根本上比Fluo-3或Fluo-4發出更多的熒光，從而產生更亮的熒光信號。此外，所有Calbryte 系列染料的設計均應使其最大吸收率發生在標準激發源附近。例如，Calbryte 520（_λmax  = 492 nm）被常見的488 nm氬離子激發光線激發。

許多探針表現出較差的信噪比的第二個原因是由于高背景。高背景可能是由于以下原因造成的：

1. 細胞不滲透
2. 高自發熒光
3. 非特異性激活/結合
4. 細胞內保留性差

這些因素中的許多與探針進入細胞并有效定位于細胞質的能力有關。縱觀過去的許多鈣指示劑，它們經常遇到兩個問題：1.探針要么是相當水溶性的，但太親水而不能滲透活細胞，要么是疏水性足夠滲透活細胞，但水溶性太差，在加載過程中會從溶液中沉淀出來，這兩種情況都不可取。Calbryte 系列熒光染料通過控制水溶性官能團和前面提到的AM酯基來解決這個問題，通過優化，Calbryte 染料能夠獲得更高的信噪比。

圖3.CHO-K細胞中內源性P2Y受體對ATP的反應。將CHO-K細胞以每100 µL 40,000個細胞的孔接種在黑色96孔板中過夜。將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 520 AM（左），Calbryte 590 AM（中）或Calbryte 630 AM（右）加入孔中，并將細胞在37°C下孵育1小時。將染料加載介質替換為200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP處理，并使用FITC通道（Calbryte 520），TRITC通道（Calbryte 590）或Texas Red通道Calbryte 630），用熒光顯微鏡成像（Keyence）。

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